[發明專利]嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CD19-CD20雙靶向性的T細胞及其應用

在審

• 申請號: 201811062721.X
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN109293781A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 伍志強;韓為東;王瑤;佟川;張文英;王曉慧
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 喬雪微;劉依云

1.一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括依次串聯的CD20ScFv、連接肽L、CD19ScFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域。

2.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.根據權利要求1所述的嵌合抗原受體，其中，所述連接肽L具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

4.編碼權利要求1-3中任意一項所述的嵌合抗原受體的基因；

優選的，編碼所述嵌合抗原受體的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.含有權利要求4所述的基因的重組表達載體；

優選的，所述重組表達載體為慢病毒表達載體；

優選的，所述慢病毒表達載體為pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

6.一種工程化CD19和CD20雙靶向性的T細胞，其特征在于，所述T細胞是由權利要求1-3中任意一項所述的嵌合抗原受體修飾的T細胞。

7.權利要求6所述的工程化CD19和CD20雙靶向性的T細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

包裝攜帶權利要求5所述的重組表達載體的慢病毒，得到病毒原液；利用得到的病毒原液感染T細胞，使T細胞表達嵌合抗原受體。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述T細胞的制備方法包括：

(1)在CD3單克隆抗體、白介素-2、重組人纖維蛋白和血清的存在下，將單個T細胞進行第一階段培養；

優選地，所述第一階段培養的方法包括：將單個T細胞與第一T細胞培養液混合，并將得到的混合液在包被有重組人纖維蛋白和CD3單克隆抗體的培養容器中進行培養，所述第一T細胞培養液含有T細胞培養液、白介素-2和血清；

進一步優選地，在第一T細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為250-350U/mL，血清的濃度為0.4-0.6體積％；

(2)在白介素-2的存在下，將所述第一階段培養的細胞進行第二階段培養；

優選地，所述第二階段培養的方法包括：將第一階段培養的細胞與第二T細胞培養液混合，并將得到的混合液在包被有重組人纖維蛋白的培養容器中進行培養，所述第二T細胞培養液含有T細胞培養液和白介素-2；

進一步優選地，在第二T細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為250-350U/mL。

9.根據權利要求6所述的方法，其中，所述感染T細胞的方法包括：

(1)在病毒原液、聚凝胺、白介素-2和重組人纖維蛋白存在下，將T細胞進行第一階段感染培養；

優選地，所述第一階段感染培養的方法包括：將T細胞與第三T細胞培養液混合，并將得到的混合液在包被有重組人纖維蛋白的容器中進行感染培養，所述第三T細胞培養液含有T細胞培養液和病毒原液；

進一步優選地，第三T細胞培養液中，所述T細胞的濃度為3×10⁵-8×10⁵個，白介素-2的濃度為250-350U/mL，聚凝胺的濃度為0.3-1.0μg/mL；

(2)在白介素-2下，將所述第一階段感染培養的細胞進行第二階段感染培養；

優選地，所述第二階段感染培養的方法包括：將所述第一階段感染培養的細胞培養于所述T細胞培養液中，所述T細胞培養液中白介素-2的濃度為250-350U/mL。

10.權利要求6所述的工程化CD19和CD20雙靶向性的T細胞在制備用于治療B細胞系惡性血液系統腫瘤的制劑中的應用；

優選的，所述B細胞系惡性血液系統腫瘤包括非霍奇金淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病和B細胞急性淋巴細胞白血病中的至少一種。