[發(fā)明專利]一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811059042.7
• 申請(qǐng)日: 2018-09-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108982339A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅靜;李小峰;張升校;王彩虹;王艷林;趙向聰;梁聰聰;許仲妍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李小峰
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 太原市科瑞達(dá)專利代理有限公司 14101
• 代理人: 趙禛

1.一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

S1、樣本要求：規(guī)格為2ml的EDTA抗凝管作為實(shí)驗(yàn)樣本；

S2、試劑準(zhǔn)備：

溶血素；

抗體混合溶液：a、別藻藍(lán)蛋白-Cy^TM7試劑標(biāo)記的CD3抗體溶液，b、藻紅蛋白-Cy^TM7試劑標(biāo)記的CD4抗體溶液，c、BV510試劑標(biāo)記的CD185抗體溶液，d、別藻藍(lán)蛋白試劑標(biāo)記的CD25抗體溶液，e、藻紅蛋白試劑標(biāo)記的CD127抗體抗體溶液，上述五種標(biāo)記過(guò)的抗體溶液體積比為1:1:1:1:4，將上述五種標(biāo)記過(guò)的抗體溶液按每人份比例混合在試劑管中，使用前振蕩混勻；

S3、外周血Tfr細(xì)胞濃度的檢測(cè)

1）、使用反向移液技術(shù)向試劑管中加入步驟S1中采集的外周血血樣50μl；

2）、向試劑管中加入步驟S2中配制的抗體溶液混合液40μl；

3）、將試劑管的頭蓋蓋合后混勻震蕩，然后室溫避光靜置15分鐘，使抗體與試劑管中的外周血血樣充分發(fā)生特異性結(jié)合；

4）、向步驟3）中的試劑管中加入450μl步驟S2中準(zhǔn)備好的溶血素，震蕩后避光靜置20分鐘；

5）、將步驟4）制得的標(biāo)本放置于流式細(xì)胞儀上以分析流式細(xì)胞圖，用BD FACSCanto^TM軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，得出外周血Tfr細(xì)胞的相對(duì)計(jì)數(shù)及絕對(duì)計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述抗體混合溶液的保存溫度為2℃至8℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S2中，別藻藍(lán)蛋白-Cy^TM7試劑標(biāo)記的CD3抗體的質(zhì)量-體積濃度為12μg/mL，藻紅蛋白-Cy^TM7試劑標(biāo)記的CD4抗體的質(zhì)量-體積濃度為12μg/mL，BV510試劑標(biāo)記的CD185抗體的質(zhì)量-體積濃度為12μg/mL，別藻藍(lán)蛋白試劑標(biāo)記的CD25抗體的質(zhì)量-體積濃度為12μg/mL，藻紅蛋白試劑標(biāo)記的CD127抗體的質(zhì)量-體積濃度為3.0μg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟1）中，在向試劑管中加入外周血血樣的過(guò)程中，使用反向加樣技術(shù)確保移液液面剛好高于不銹鋼網(wǎng)，不要接觸微球，而且避免血液污染管壁。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟2）中，在向試劑管中加入抗體的過(guò)程中，槍尖傾斜，將抗體加在管底另一側(cè)，不要觸碰到血樣。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟4）中，使用室溫去離子水稀釋溶血素，溶血素與室溫去離子水的體積比為1:10。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外周血濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞濃度檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟5）中，如待測(cè)試樣不能及時(shí)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，先將待測(cè)試樣放入避光冰箱冷藏保存。