[發明專利]一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法

在審

• 申請號: 201811059042.7
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN108982339A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 羅靜;李小峰;張升校;王彩虹;王艷林;趙向聰;梁聰聰;許仲妍
• 申請（專利權）人: 李小峰
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司 14101
• 代理人: 趙禛

1.一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

S1、樣本要求：規格為2ml的EDTA抗凝管作為實驗樣本；

S2、試劑準備：

溶血素；

抗體混合溶液：a、別藻藍蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD3抗體溶液，b、藻紅蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD4抗體溶液，c、BV510試劑標記的CD185抗體溶液，d、別藻藍蛋白試劑標記的CD25抗體溶液，e、藻紅蛋白試劑標記的CD127抗體抗體溶液，上述五種標記過的抗體溶液體積比為1:1:1:1:4，將上述五種標記過的抗體溶液按每人份比例混合在試劑管中，使用前振蕩混勻；

S3、外周血Tfr細胞濃度的檢測

1）、使用反向移液技術向試劑管中加入步驟S1中采集的外周血血樣50μl；

2）、向試劑管中加入步驟S2中配制的抗體溶液混合液40μl；

3）、將試劑管的頭蓋蓋合后混勻震蕩，然后室溫避光靜置15分鐘，使抗體與試劑管中的外周血血樣充分發生特異性結合；

4）、向步驟3）中的試劑管中加入450μl步驟S2中準備好的溶血素，震蕩后避光靜置20分鐘；

5）、將步驟4）制得的標本放置于流式細胞儀上以分析流式細胞圖，用BD FACSCanto^TM軟件獲取10000個細胞進行檢測，得出外周血Tfr細胞的相對計數及絕對計數。

2.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述抗體混合溶液的保存溫度為2℃至8℃。

3.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟S2中，別藻藍蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD3抗體的質量-體積濃度為12μg/mL，藻紅蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD4抗體的質量-體積濃度為12μg/mL，BV510試劑標記的CD185抗體的質量-體積濃度為12μg/mL，別藻藍蛋白試劑標記的CD25抗體的質量-體積濃度為12μg/mL，藻紅蛋白試劑標記的CD127抗體的質量-體積濃度為3.0μg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟1）中，在向試劑管中加入外周血血樣的過程中，使用反向加樣技術確保移液液面剛好高于不銹鋼網，不要接觸微球，而且避免血液污染管壁。

5.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟2）中，在向試劑管中加入抗體的過程中，槍尖傾斜，將抗體加在管底另一側，不要觸碰到血樣。

6.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟4）中，使用室溫去離子水稀釋溶血素，溶血素與室溫去離子水的體積比為1:10。

7.根據權利要求1所述的一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟S3的步驟5）中，如待測試樣不能及時在流式細胞儀上進行分析，先將待測試樣放入避光冰箱冷藏保存。