[發明專利]一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法

在審

• 申請號: 201811059042.7
• 申請日: 2018-09-12
• 公開（公告）號: CN108982339A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 羅靜;李小峰;張升校;王彩虹;王艷林;趙向聰;梁聰聰;許仲妍
• 申請（專利權）人: 李小峰
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司 14101
• 代理人: 趙禛

本發明涉及一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，屬于細胞檢測篩查方法技術領域，解決現有技術中Tfr細胞檢測誤差大、步驟繁瑣的技術問題，解決方案為本方法包括以下步驟：S1、樣本要求；S2、試劑準備：溶血素；抗體混合溶液：別藻藍蛋白?Cy^TM7試劑標記的CD3抗體溶液、藻紅蛋白?Cy^TM7試劑標記的CD4抗體溶液、BV510試劑標記的CD185抗體溶液、別藻藍蛋白試劑標記的CD25抗體溶液、藻紅蛋白試劑標記的CD127抗體抗體溶液，將上述五種標記過的抗體溶液按每人份比例混合在試劑管中，使用前振蕩混勻；S3、外周血Tfr細胞濃度的檢測。本發明可提供抗體混合試劑，質量控制較好，簡化實驗步驟，減少試驗誤差，細胞檢測精度高，是一種可實現臨床多個樣本同時檢驗的單平臺技術。

技術領域

本發明屬于細胞檢測篩查方法技術領域，特別涉及一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法。

背景技術

濾泡調節性T細胞(follicular regulatory T cell，以下簡稱Tfr細胞)的數目和功能對維持自身免疫系統的穩態與平衡起著至關重要的作用。Tfr細胞是一類新發現的調節性T細胞(Treg)亞群，其特點是表面表型與濾泡輔助性T細胞(T follicular helpercell，以下簡稱Tfh細胞)和效應Treg細胞均有重疊，因此，Tfr細胞在功能上具有Tfh細胞和Treg細胞的雙重特性，可以調節Tfh細胞數目、控制生發中心的反應、防止自身反應性B細胞產生，具體表現為Tfr細胞在體外能抑制T細胞的增殖，在體內能抑制Tfh細胞的功能。Tfr細胞表面表達的CD185抗體（CXCR5）能使其定位于生發中心，表面表達的CD127和PD-1使其具有抑制體液免疫的功能。更重要的是，Tfr細胞對B細胞反應的抗體親和力的成熟和漿細胞的分化均起到了重要的作用，研究發現，許多患類風濕關節炎（RA）、系統性紅斑狼瘡（SLE）、原發性干燥綜合征（pSS）、重癥肌無力(MG)等自身免疫疾病的病人，它們的外周血Tfr細胞絕對計數（即濃度）明顯降低。

我們的前期研究發現，雖然Tfr細胞比例異常可以提示很多疾病，但其絕對值計數變化可能更能反映諸多自身免疫疾病的真正面貌，且與患者的治療和預后息息相關。然而，因目前流式檢測方法需要多次對樣本加抗體，致使操作比較繁瑣與困難，樣本操作時間長，試驗結果穩定性差，且絕大多數試驗室僅能測量目標細胞的百分比，難以在臨床上廣泛應用。

雖然目前外周血Tfr細胞濃度（絕對計數）可用多步驟流式細胞儀測試方法替代，但存在如下缺點和不足：1.要從多個公司購買試劑，質量控制很難；2.提取單個核細胞步驟繁瑣，操作誤差大，難以比較不同實驗室的結果；3.耗時多，不能實現臨床多個樣本同時檢測；4.精度不夠，且結果穩定性差；5.僅測量目標細胞的百分比，無更精準的絕對值測量。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，解決現有技術中Tfr細胞檢測誤差大、步驟繁瑣的技術問題，提供一種單平臺的外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法。

本發明通過以下技術方案予以實現。

一種外周血濾泡調節性T細胞濃度檢測方法，包括以下步驟：

S1、樣本要求：規格為2ml的EDTA抗凝管作為實驗樣本；

S2、試劑準備：

溶血素；制備好的溶血素儲存在玻璃容器中，于室溫下1個月內是穩定的；

抗體混合溶液：a、別藻藍蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD3抗體溶液，b、藻紅蛋白-Cy^TM7試劑標記的CD4抗體溶液，c、BV510試劑標記的CD185抗體溶液，d、別藻藍蛋白試劑標記的CD25抗體溶液，e、藻紅蛋白試劑標記的CD127抗體抗體溶液，上述五種標記過的抗體溶液體積比為1:1:1:1:4，將上述五種標記過的抗體溶液按每人份比例混合在試劑管中，使用前振蕩混勻；