[發明專利]一種西瓜倍性檢測方法

有效

• 申請號: 201811058800.3
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109207565B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 張娜;黃興;曾紅霞;湯謐;任儉;孫玉宏;李其友;陳偉;熊建順;畢秋榮
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N5/04
• 代理公司: 宜昌市慧宜專利商標代理事務所(特殊普通合伙) 42226
• 代理人: 姜榮華

本發明公開了一種西瓜倍性檢測方法。步驟包括：原生質體制備、總DNA提取、定量PCR法檢測DNA濃度。以不同倍性西瓜葉片為材料分離原生質體，提取等量原生質體中的總DNA，根據西瓜5S rDNA序列設計定量PCR特異引物，以不同濃度DNA繪制Ct值與DNA濃度的標準曲線，根據不同倍性西瓜DNA溶液測得Ct值換算其濃度并計算其倍性。本發明對樣品要求較低，除營養物質較多的果實、種子之外的其他植物組織均可進行原生質體分離；對儀器設備要求較低，價格低廉的熒光定量PCR儀可滿足需求，無需購置價格相對昂貴的流式細胞儀；準確性與流式細胞法相近，檢測精度高于氣孔保衛細胞葉綠體計數法，操作流程較染色體計數法更容易實現；為西瓜倍性檢測提供了新的途徑。

技術領域

本發明涉及倍性檢測技術領域，更具體涉及一種西瓜倍性的檢測方法。

技術背景

中國是西瓜生產與消費第一大國，西瓜是我國重要的經濟作物之一。無籽西瓜以其食用方便的特性廣受消費者青睞，在西瓜生產中占重要地位。無籽西瓜制種較繁瑣，需通過二倍體和四倍體材料雜交獲得，因此準確、高效的倍性檢測方法對無籽西瓜制種及親本創制尤為重要。目前常用的細胞倍性檢測方法為流式細胞儀檢測法，其操作簡便，但對樣品要求較高，僅幼嫩且細胞分裂不旺盛的組織檢測效果較好，對分裂旺盛、老化的植物組織進行檢測易出現雜峰，影響檢測結果。同時，流式細胞儀價格較高，在醫學檢測中應用較多，常規植物研究實驗室較少配備，且其相關試劑耗材價格較高，日常管理、保養較繁瑣。除此之外，染色體計數法也是較為準確的倍性鑒定方法之一，但其對制片要求較高，常需開展大量染色體制片工作才能獲得理想的染色體切片。相比之下，基于分子標記的分子生物學檢測方法則對樣品、儀器設備要求較低，如GISH、FISH等方法已成功應用于植物倍性檢測，但尚未檢索到關于定量PCR方法用于倍性檢測的報道。

發明內容

本發明目的在于提出一種西瓜倍性檢測方法，以西瓜葉片為材料制備原生質體后提取總DNA，通過定量PCR法檢測模板DNA濃度，進而確定所選材料倍性。該方法操作容易，對儀器設備、樣品來源要求較低且結果準確，應用范圍廣泛。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種西瓜倍性檢測方法，其步驟為：

A、以二倍體西瓜葉片為材料分離原生質體，將葉片切成10mm × 0.1mm細條，置于培養皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm搖床、24°C、遮光條件下反應4-6小時；

反應完成后100g離心收集原生質體，鏡檢；

以未知倍性西瓜葉片為材料分離原生質體，將葉片切成10mm × 0.1mm細條，置于培養皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm搖床、24°C、遮光條件下反應4-6小時；

反應完成后100g離心收集原生質體，鏡檢；

B、通過血球計數板將步驟A中所述的二倍體和未知倍性西瓜原生質體調至相同濃度，分別取等體積原生質體懸浮液提取總DNA；

C、以西瓜5S rDNA序列片段為模板設計定量PCR引物；

5S rDNA序列片段序列如下：

5’-CGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCAACCAGAACTCCGCAGTTAAGCGTGCTGGGACGAGAGTAGTACTAAGTTGGGTGACCACTTGGGAAGTCCTCGTGTTGCAC-3’；

引物序列如下：

正向引物：5’-CGATCATACCAGCACTAATGCACC-3’；

反向引物：5’-CTCAACACGAGGACTTCCCAA-3’；

D、取二倍體西瓜原生質體的DNA溶液進行qPCR檢測測定其模板DNA的Ct值；