[發(fā)明專利]一種西瓜倍性檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811058800.3
• 申請(qǐng)日: 2018-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109207565B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張娜;黃興;曾紅霞;湯謐;任儉;孫玉宏;李其友;陳偉;熊建順;畢秋榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12N5/04
• 代理公司: 宜昌市慧宜專利商標(biāo)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42226
• 代理人: 姜榮華

1.一種西瓜倍性檢測(cè)方法，其步驟為：

A、以二倍體西瓜葉片為材料分離原生質(zhì)體，將葉片切成10mm × 0.1mm細(xì)條，置于培養(yǎng)皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm搖床、24°C、遮光條件下反應(yīng)4-6小時(shí)；

反應(yīng)完成后100g離心收集原生質(zhì)體，鏡檢；

以未知倍性西瓜葉片為材料分離原生質(zhì)體，將葉片切成10mm × 0.1mm細(xì)條，置于培養(yǎng)皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm搖床、24°C、遮光條件下反應(yīng)4-6小時(shí)；

反應(yīng)完成后100g離心收集原生質(zhì)體，鏡檢；

B、通過(guò)血球計(jì)數(shù)板將步驟A中所述的二倍體和未知倍性西瓜原生質(zhì)體調(diào)至相同濃度，分別取等體積原生質(zhì)體懸浮液提取總DNA；

C、以西瓜5S rDNA序列片段為模板設(shè)計(jì)定量PCR引物；

5S rDNA序列片段序列如下：

5’-CGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCAACCAGAACTCCGCAGTTAAGCGTGCTGGGACGAGAGTAGTACTAAGTTGGGTGACCACTTGGGAAGTCCTCGTGTTGCAC-3’；

引物序列如下：

正向引物：5’-CGATCATACCAGCACTAATGCACC-3’；

反向引物：5’-CTCAACACGAGGACTTCCCAA-3’；

D、取二倍體西瓜原生質(zhì)體的DNA溶液進(jìn)行qPCR檢測(cè)測(cè)定其模板DNA的Ct值；

取未知倍性西瓜原生質(zhì)體的DNA溶液進(jìn)行qPCR檢測(cè)測(cè)定其模板DNA的Ct值；

E、比較二倍體和未知倍性西瓜原生質(zhì)體中DNA總量，若未知倍性西瓜原生質(zhì)體的DNA總量與二倍體相同，則未知倍性西瓜為二倍體，若未知倍性西瓜原生質(zhì)體的DNA總量為二倍體的2倍，則未知倍性西瓜為四倍體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種西瓜倍性檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟A中所述的酶液成分為：1.2%纖維素酶R10、0.25%離析酶R10、0.4 M甘露醇、20 mM氯化鉀和10 mM氯化鈣，pH調(diào)至5.8。