[發明專利]一種集靶向、光熱于一體的紅細胞仿生型納米粒的制備方法

在審

• 申請號: 201811055247.8
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109091673A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 王秉;姚舒婷;單心怡;華稱祥;胡智文;萬軍民
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;A61K9/50;A61K9/107;A61K47/46;A61K47/34;A61K47/22;A61K47/36;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙) 33265
• 代理人: 蔣文

1.一種集靶向、光熱于一體的紅細胞仿生型納米粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取6~8周大小的ICR小鼠數只，使用毛細管進行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在1-5℃，1500-2500 r/min下離心8-12 min后去除上層的血清和其他血細胞層，得到的紅細胞沉淀用冷處理后的1×PBS洗滌3~5次，備用；

2）向步驟1）得到的紅細胞沉淀中加入相當于紅細胞沉淀55-65倍體積的冷處理后的0.25×PBS低滲2~3 h，接著在9000-11000 r/min下離心15~20 min，棄去上層液體，下層淡粉色的沉淀即為紅細胞膜，再用0.25×PBS反復洗滌3~5次使得提取的紅細胞膜更為純凈，備用；

3）將阿霉素溶于水中，配制得到濃度為4-6wt%的阿霉素溶液；將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成濃度為1.5-2.5wt%的聚乳酸-羥基乙酸溶液；將聚多巴胺溶于水中，配制成濃度為2.5-3.5wt%的聚多巴胺溶液；將所有溶液置于1-5℃的環境中預冷，備用；

4)取2~2.5 mg吲哚菁綠加入至3~5 mL聚乳酸-羥基乙酸溶液中，充分混勻，得到吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸溶液，備用；

5）取600~700μL阿霉素溶液加入到3~5 mL 吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸溶液中，超聲乳化30~40 s，制得W/O初乳，備用；

6）將W/O初乳立即轉移到6~10 mL聚多巴胺溶液中，超聲30~40 s，制得W/O/W復乳液，備用；

7）將W/O/W復乳液逐滴加入到40~50 mL水中，攪拌，陳化3~4 h，待有機溶劑揮發完全后，將得到的納米粒溶液以800-1200 r/min離心去除大顆粒，再用0.45μm的微孔濾膜過濾，得阿霉素-吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸納米粒溶液，備用；

8）稱取葉酸220~225 mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽192~197 mg，加入至30~40 mL 的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中，攪拌完全溶解，稱取525~530 mg殼寡糖，攪拌下加入葉酸溶液，避光反應3~5 h，備用；

9）向步驟8）得到的反應液中加入0.1 mol/L的鹽酸溶液，調節其pH值至6.8-7.2，滴加過程中可見溶液逐漸變渾濁，有沉淀析出；將反應液抽濾2-4次，去除沉淀，得到濾液，將其置于透析袋中，透析20-30 h后將其凍干得到黃色海綿狀固體，即葉酸殼寡糖，備用；

10）稱取30~35 mg葉酸殼寡糖和16~18 mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，溶于10~15 mL去離子水中，將其加入到步驟7）得到的阿霉素-吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸納米粒溶液中，室溫下反應3~5 h后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾即得阿霉素-葉酸殼寡糖-吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸納米混懸液，備用；

11）將步驟10）得到的納米混懸液在1-5℃下離心，去除上清液，沉淀用去離子水洗滌3~5次，即得到阿霉素-葉酸殼寡糖-吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸納米溶液，備用；

12）將步驟2）得到的紅細胞膜用1×PBS按照全血體積重懸后水浴超聲2~3 min，再利用擠出儀分別通過400 nm和200 nm的聚碳酸酯多孔膜擠出，得到的細胞膜懸液與步驟11）得到的阿霉素-葉酸殼寡糖-吲哚菁綠-聚乳酸-羥基乙酸納米粒溶液以1.8-2.2:1的體積比混合均勻后，共同通過200 nm的膜混勻反復擠出至少8次，得到紅細胞仿生型納米粒，通過離心去除上層未包裹的多余細胞膜，即可得到純凈的紅細胞仿生型納米粒。

2.如權利要求1所述的一種集靶向、光熱于一體的紅細胞仿生型納米粒的制備方法，其特征在于，步驟3）中，制備所得的溶液均置于4℃的冰箱中預冷。

3.如權利要求1所述的一種集靶向、光熱于一體的紅細胞仿生型納米粒的制備方法，其特征在于，步驟5）、6）中，超聲乳化功率為500~600 W。

4.如權利要求1所述的一種集靶向、光熱于一體的紅細胞仿生型納米粒的制備方法，其特征在于，步驟7）中，攪拌速度為300-500 r/min。