[發明專利]CHO-K1懸浮馴化培養基及馴化方法

有效

• 申請號: 201811054625.0
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109321519B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 肖志華;梁欠欠
• 申請（專利權）人: 上海奧浦邁生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 張新鑫;許亦琳

本發明提供一種CHO?K1懸浮馴化培養基及馴化方法，所述培養基至少包括：CD CHO Medium、IGF?1、泊洛沙姆188、條件培養基（Condition Medium）。采用上述培養基馴化CHO?K1細胞使得細胞培養時間短（小于2個月），擴增速度快，細胞不結團且活率高。

技術領域

本發明涉及一種CHO-K1懸浮馴化培養基及馴化方法，屬于生物技術領域。

背景技術

CHO，是1957年美國科羅拉多大學Dr.Theodore T.Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細胞，是生物工程上廣泛使用的細胞系。該細胞具有不死性，可以傳代百代以上，是生物工程上廣泛使用的細胞。另外CH0細胞在基因工程使用中還有一個優點，該細胞屬于成纖維細胞(fibroblast)，是一種非分泌型細胞，它本身很少分泌CHO內源蛋白，因此對目標蛋白分離純化工作十分有利。可形成有活性的二聚體(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO為表達復雜生物大分子的理想宿主。

工業生產上應用較多的是CHO-K1細胞，為轉化細胞系，細胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細胞。ATCC保存CHO-K1細胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達。該細胞可從各大保藏中心采購或者各個實驗室保存的細胞獲得。

該細胞系通常是在10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)中培養。細胞在貼壁培養時，生長數量依賴于培養面積，即使在融合率90％以上，單位面積的細胞密度很難超過10⁵cells/m，而且傳統的貼壁培養模式中，需要在培養基中添加10％的優質胎牛血清，一方面增加了培養成本，另一方面由于血清中很容易攜帶外源病毒、補體等物質而導致細胞的培養效果不穩定或者引入安全風險。所以，在現在生物醫藥開發中，通常將貼壁血清培養的CHO-K1細胞懸浮馴化至無血清懸浮高密度生長。但由于目前沒有效果突出的馴化培養基及馴化方法，導致貼壁懸浮馴化過程漫長(5-10個月)且存在較大的失敗概率，即使馴化成功，也容易出現細胞易結團、活率低、倍增時間長等缺點。

因此，提供一種性能優異的培養基及培養方法十分必要。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種CHO-K1懸浮馴化培養基及馴化方法，用于解決現有技術中CHO-K1培養時間長、易結團、活率低、以及倍增時間長的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種CHO-K1懸浮馴化無血清培養基，所述培養基至少包括以下重量份的組分：

CD CHO Medium：為一款商業化無血清培養基，且化學成分限定(Chemicallydefined)，是目前市場上最常用地CHO-K1細胞懸浮培養基。

IGF-1：為大腸桿菌表達的重組蛋白，為胰島素的替代物，價格較胰島素便宜數十倍，且不是動物源成分，無外源病毒引入的風險。

泊洛沙姆188：Poloxamer188，聚氧乙烯聚氧丙烯，為常用藥用輔料，被用作乳化劑或者增溶劑。其低濃度下溶液可以有效地減少細胞接團現象。

所述血清為FBS。

條件培養基：Condition Medium(CM)，條件培養基。細胞培養3-4天后，通過離心或者過濾去除細胞后的上清，此上清中含有細胞生長過程中分泌的一些因子，對細胞的生長和分裂有促進作用。所述條件培養基為CHO-K1細胞的條件培養基，制備條件培養基的初始培養基可以為F-12K培養基或者其他適于培養CHO-K1的培養基。

本發明的另外一個方面提供了一種CHO-K1懸浮馴化培養基，所述CHO-K1懸浮馴化培養基為采用上述無血清培養基添加不超過無血清培養基總重量10％的血清獲得。