[發明專利]CHO-K1懸浮馴化培養基及馴化方法

有效

• 申請號: 201811054625.0
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109321519B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 肖志華;梁欠欠
• 申請（專利權）人: 上海奧浦邁生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 張新鑫;許亦琳

1.一種CHO-K1懸浮馴化無血清培養基，其特征在于，所述培養基由以下重量份或濃度的組分組成：

2.一種CHO-K1懸浮馴化培養基，其特征在于，所述CHO-K1懸浮馴化培養基為將權利要求1所述無血清培養基添加不超過無血清培養基總重量10％的血清獲得。

3.一種CHO-K1細胞馴化方法，所述方法至少包括以下步驟：

(1)對CHO-K1細胞貼壁降血清三級培養，降血清三級培養是指對CHO-K1細胞分3次培養，將CHO-K1細胞在含有10％FBS的F-12K培養基中培養，當細胞匯合度到70～80％時，加胰酶消化，緩慢吹打混勻，以0.4×10⁵cells/ml的密度接種至10ml含10％FBS的F-12K培養基中傳代，靜止培養，當細胞匯合度到70～80％，加胰酶消化并以同樣的密度接種至10ml含5％FBS的F-12K培養基中，用同樣的方法將血清逐步降低至2.5％，培養3代；

(2)懸浮馴化：將CHO-K1細胞置于如權利要求2所述的培養基中懸浮培養；所述培養基中血清添加量為權利要求1所述的培養基重量的1～3％，條件培養基(Condition Medium，CM)制備：細胞在含有2.5％FBS的F-12K培養基2-3天后，收集培養上清200g離心5分鐘后，用0.22um的無菌濾膜過濾；

(3)懸浮除血清培養：將CHO-K1細胞依次置于血清添加量為無血清培養基重量的1～3％的如權利要求2所述的培養基、權利要求1所述的培養基、按權利要求1所述的培養基減除IGF-1、泊洛沙姆188成分配制的M培養基中培養，取1％FBS條件下細胞培懸液以200g水平離心5mins，收集上清，經0.22μM的一次性過濾器過濾，作為此階段條件培養基。

4.根據權利要求3所述的CHO-K1細胞馴化方法，其特征在于：所述步驟(1)、(2)以及(3)中每次培養細胞至細胞傳代2～3次后進入后續步驟。

5.根據權利要求3所述的CHO-K1細胞馴化方法，其特征在于：所述步驟(1)中培養條件為36～38℃，體積分數為5～8％CO₂，pH為7.0～7.4，培養箱中靜置培養，所述步驟(2)中培養條件為36～38℃，體積分數為5～8％CO₂，pH為7.0～7.4，置于搖床中培養，轉速為110～130rpm，所述步驟(3)中培養條件為36～38℃，體積分數為5～8％CO₂，pH為7.0～7.4，置于搖床中培養，轉速為110～130rpm。

6.根據權利要求3所述的CHO-K1細胞馴化方法，其特征在于：所述步驟(2)中培養時，當細胞密度低于5×10⁵cells/ml或者細胞活率低于50％，應加入細胞至活細胞數不低于10×10⁵cells/ml。

7.根據權利要求3所述的CHO-K1細胞馴化方法，其特征在于：所述步驟(3)還包括將細胞在M培養基中培養之后置于CD CHO Medium中培養。

8.如權利要求1所述的CHO-K1懸浮馴化無血清培養基以及如權利要求2所述的CHO-K1懸浮馴化培養基用于CHO-K1細胞馴化培養的用途。