[發(fā)明專利]貴細中草藥西洋參的重組酶介導(dǎo)擴增恒溫檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811054608.7
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109385487B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈泓;程奇;王知堅;蔣超;鮑傳正;李超;袁媛;陳碧蓮;孫晗;韓曉;李文庭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省食品藥品檢驗研究院;浙江善測禾騎士生物科技有限公司;中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明提供一種供用于檢測中藥中西洋參物種（Panax quinquefolius）的重組酶介導(dǎo)擴增（Recombinase?aid Amplification，RAA）恒溫檢測方法和檢測試劑盒。檢測試劑盒包括一條正向引物SEQ ID NO.1、一條反向引物SEQ ID NO.2、一條特異性熒光探針SEQ ID NO.3、反應(yīng)液、重組聚合酶和對照品。本發(fā)明的試劑盒特異性強；檢測靈敏度高，可達到0.10fg/μL；準(zhǔn)確度高、可靠；操作簡便快捷，適合現(xiàn)場檢測，具有廣泛的應(yīng)用場景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于貴細中草藥檢測領(lǐng)域和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，屬于如何采用重組酶介導(dǎo)擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)恒溫檢測技術(shù)并結(jié)合特異的引物和熒光探針鑒定中藥中是否含有西洋參(Panax quinquefolius) 成分的方法。

背景技術(shù)

2017年以來，我國中醫(yī)藥新政密集出臺，尤其是《中醫(yī)藥法》的實施以及《中藥材產(chǎn)業(yè)扶貧行動計劃(2017-2020)年》的發(fā)布，為中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來新機遇。在此背景下，全國中藥材供給規(guī)模繼續(xù)擴大，流通環(huán)節(jié)資源優(yōu)化提升，集約化產(chǎn)地加工方式凸顯，“互聯(lián)網(wǎng)+”新型貿(mào)易方式興起，中藥材流通市場加快轉(zhuǎn)型升級，中藥進出口貿(mào)易增加。去年我國進口中藥材9.10萬噸，同比增加13.62％，平均進口價格2.87美元/公斤，同比上漲14.15％，中藥材進口總額2.61億美元，同比增長29.69％，遠高于我國貨物進口額18.7％的同比增長。我國進口的主要品種有龍眼、西洋參、鹿茸、西紅花、乳香、沒藥及血竭等。

西洋參是唯一一個上榜進出口前十品種中進口金額高于出口金額的品種。很多長期經(jīng)營西洋參的人都知道，進口西洋參存在很多魚龍混雜的貓膩。美國進口的花旗參非常少，甚至不如加拿大。據(jù)各中藥行業(yè)分析報道中，我們每年“進口”的西洋參1500噸左右，但根據(jù)統(tǒng)計正式從海關(guān)進來的不到800噸，甚至更少，且有很多從香港轉(zhuǎn)關(guān)進來的，不會影響進口數(shù)量。目前我國西洋參中存在大量的混偽、造假行為，嚴(yán)重影響了中藥質(zhì)量和用藥安全，如何簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測標(biāo)稱的西洋參中藥是否為真正的西洋參成為亟待解決的問題。

重組酶介導(dǎo)擴增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技術(shù)也是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。與RPA不同的是，RAA擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNAbinding，SSB)的幫助下，使模板DNA 解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級增長，通常在1h內(nèi)即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。在 RAA反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個RAA擴增過程，20分鐘內(nèi)，可實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。整個反應(yīng)簡單快速，因為不需要高溫循環(huán)，所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用，適用于貴細中草藥真?zhèn)舞b定快速檢測領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供貴細中草藥西洋參(Panax quinquefolius)的重組酶介導(dǎo)擴增恒溫檢測方法及試劑盒。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種貴細中草藥西洋參核酸的檢測試劑盒，包括：西洋參正向引物、反向引物以及特異性熒光探針，其中所述西洋參正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述西洋參反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ IDNO.3，其5’端標(biāo)記有熒光報告基團，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團。

在一些實施方案中，所述特異性熒光探針的熒光報告基團選自FAM、VIC、 JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCY1或TAMRA中的一種。