[發明專利]貴細中草藥西洋參的重組酶介導擴增恒溫檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201811054608.7
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109385487B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 沈泓;程奇;王知堅;蔣超;鮑傳正;李超;袁媛;陳碧蓮;孫晗;韓曉;李文庭
• 申請（專利權）人: 浙江省食品藥品檢驗研究院;浙江善測禾騎士生物科技有限公司;中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1. 一種中藥西洋參（Panax quinquefolius）的RAA檢測方法，所述檢測方法包括西洋參正向引物、西洋參反向引物和特異性熒光探針，其特征在于，所述西洋參正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述西洋參反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；

所述檢測方法包括如下步驟：

（1）從待測中藥樣品中提取基因組DNA作為模板；采用所述西洋參正向引物和反向引物以及特異性熒光探針對模板進行RAA擴增；所述RAA擴增的反應溫度為30～42℃，反應時間為5～30min；所述RAA擴增的反應程序為：39℃，40s，一個循環；39℃，30s一個循環，20min，40個循環；

（2）按照如下的方法進行判斷：

根據熒光通道的熒光曲線，按照如下方法確定所述待測中藥樣品是否含有西洋參：若熒光通道熒光曲線呈“S”型且CT值≤35，則所述待測中藥樣品含有或候選含有西洋參；當熒光曲線不呈“S”型或CT值＞35，所述待測中藥樣品不含有西洋參。

2.用于檢測或輔助檢測中藥西洋參的檢測試劑盒，其特征在于，包括引物混合液和特異性熒光探針，其中所述引物混合液包括西洋參正向引物和反向引物，所述西洋參正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述西洋參反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述特異性熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；

所述試劑盒還包括西洋參標準品、A Buffer、B Buffer、RAA干粉試劑和ddH2O；

所述A Buffer為20％PEG；所述B Buffer為280mM MgAc；

所述RAA干粉試劑的成分如下：1mmol/L dNTP，90ng/μL SSB蛋白，120ng/μL recA重組酶蛋白或30ng/μL Rad51，30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine，20％PEG，5mmol/L二硫蘇糖醇，100ng/μL肌酸激酶，Exo核酸外切酶。

3.根據權利要求1所述的檢測方法或權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光報告基團選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種；所述熒光淬滅基因選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或TAMRA中的一種。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述西洋參標準品為含西洋參全基因組部分序列的陽性質粒；所述西洋參全基因組部分序列如SEQ ID NO.4所示。