[發明專利]固定化酶催化法制備D-赤蘚酮糖的方法

有效

• 申請號: 201811054510.1
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109251948B
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 黃華;高睿迪
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種利用固定化酶連續催化赤藻糖醇制備D-赤蘚酮糖的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）PCR擴增赤藻糖醇氧化酶、赤蘚酮糖激酶、乳酸脫氫酶、ATP再生酶、磷酸水解酶基因片段，然后連接到質粒上；再將質粒轉入細胞中；

（2）將轉入了質粒的細胞置于37^oC、含100μM氨芐青霉素的LB液體培養液中進行培養，當細胞增長至對數期后，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導蛋白表達4小時以上，收集細胞；

（3）將步驟（2）收集的細胞破碎、離心，在上清液中逐量加入硫酸銨至終濃度為30-50%W/V，直至有蛋白固體析出；離心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris緩沖液中，再經G25尺寸排阻柱除鹽、經DEAE Seplite FF陰離子交換柱分離，得到純化的赤藻糖醇氧化酶、赤蘚酮糖激酶、乳酸脫氫酶、ATP再生酶、磷酸水解酶液體酶；

（4）將赤藻糖醇氧化酶、赤蘚酮糖激酶、乳酸脫氫酶與ATP再生酶的純化混合酶溶解在緩沖液中，隨后加入環氧樹脂，室溫攪拌24小時以上，酶固定在環氧樹脂上，過濾出環氧樹脂，用清水和緩沖液洗滌，最后在4^oC干燥；磷酸水解酶依同樣的步驟單獨固定；

步驟（4）所述的緩沖液為100mM pH值6.5 - 9.0的磷酸鉀溶液；

（5）在緩沖液中加入赤藻糖醇、丙酮酸鈉、多聚磷酸、三磷酸腺苷二鈉鹽ATP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸單鈉鹽、氯化鎂和氯化鉀，調節pH 值到8.0，加入赤藻糖醇氧化酶、赤蘚酮糖激酶、乳酸脫氫酶與ATP再生酶的固定化混合酶，在25-40^oC 輕微攪拌反應4小時以上，生成D-赤蘚酮糖-4-磷酸；所述的緩沖液是pH值8.0的Tris.HCl溶液；

過濾反應液回收環氧樹脂及其固定化酶，在濾液中加入草酸鋇和兩倍濾液體積的乙醇，用于沉淀D-赤蘚酮糖-4-磷酸及磷酸腺苷；離心收集沉淀，溶解在pH值小于7的Tris緩沖液中，加入無水硫酸鈉析出不溶性硫酸鋇；過濾除去不溶性鋇鹽，并將濾液pH值上調到7.0，上樣陰離子交換樹脂柱，并以梯度碳酸氫氨水溶液洗脫，碳酸氫氨濃度從0逐漸升至1.0M，未含磷酸基團的有機雜質最先從交換柱中洗脫出來，之后，含單磷酸基團的D-赤蘚酮糖-4-磷酸逐漸被洗脫出來，而含多個磷酸基團的ADP/ATP最后洗脫出；收集到的D-赤蘚酮糖-4-磷酸最后經G25尺寸排阻柱除鹽得到純化的D-赤蘚酮糖-4-磷酸鈉；

（6）將D-赤蘚酮糖-4-磷酸鈉、氯化鎂溶解在pH值7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入固定化磷酸水解酶，在25-40^oC輕微攪拌反應2小時以上，然后過濾分離環氧樹脂及其固定化酶；濾液經過陰離子交換樹酯柱層析，含磷酸化合物吸附在樹脂上而D-赤蘚酮糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脫鹽得到純化的D-赤蘚酮糖。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述的PCR擴增，是以大腸桿菌（Escherichia coli）、包皮垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis）或苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti ）的染色體為模板。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述的質粒為pET23a。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述的細胞為大腸桿菌BL21菌株。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的終濃度為0.4-0.5 mM。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）所述的DEAE Seplite FF陰離子交換柱分離，是以梯度NaCl水溶液做洗脫液，濃度從0 逐漸提升到1.0 M。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）所述的純化混合酶中，赤藻糖醇氧化酶、赤蘚酮糖激酶、乳酸脫氫酶與ATP再生酶的活性單位比是1:2-3:1:2-3。