[發明專利]基于AAV病毒的基因編輯表達盒

在審

• 申請號: 201811054096.4
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN110885818A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 褚貝貝;楊國宇;王江;劉忠虎;汪新建;鐘凱;魯維飛;郭豫杰
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/864;C12N15/90
• 代理公司: 北京永新同創知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 程大軍;欒星明

1.一種表達盒，其包含分別位于表達盒5'端和3'端的兩個反向末端重復(ITR)，以及位于兩個反向末端重復之間的第一啟動子、和與第一啟動子可操作地連接的編碼Cas9多肽的第一多核苷酸、及第二啟動子、和與第二啟動子可操作地連接的編碼單向導RNA(sgRNA)的第二多核苷酸，其中所述表達盒的大小不超過4.3kb。

2.權利要求1的表達盒，其中所述Cas9多肽為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(SaCas9)，如SEQ ID NO:7所示，其任選地與核定位序列(NLS)連接，并且所述sgRNA為SaCas9對應的sgRNA。

3.權利要求1的表達盒，其中所述第一啟動子和所述第二啟動子的大小總共不超過300bp。

4.權利要求1的表達盒，其中所述第一啟動子是SEQ ID NO:5所示的EF1α啟動子。

5.權利要求1的表達盒，其中所述第二啟動子是tRNA編碼序列。

6.權利要求5的表達盒，其中所述tRNA編碼序列是哺乳動物的tRNA，例如Gln tRNA、ProtRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、Cys tRNA、或Glu tRNA。

7.權利要求5的表達盒，其中所述tRNA編碼序列是SEQ ID NO:4所示的Gln tRNA。

8.權利要求1的表達盒，其中所述第二啟動子是小鼠γ皰疹病毒-68(MHV68)RNA。

9.權利要求1的表達盒，其中位于表達盒5'端的反向末端重復AAV2 ITR 5'序列如SEQID NO:2所示，位于表達盒3'端的反向末端重復AAV2 ITR 3'序列如SEQ ID NO:3所示。

10.權利要求1的表達盒，其中所述第一多核苷酸還與報告分子符合讀碼框地連接，所述報告分子大小不超過800bp。

11.權利要求10的表達盒，其中所述報告分子選自EGFP、mCherry和NanoLuc。

12.權利要求1的表達盒，其從5'-3'方向按順序包含AAV2ITR 5'、EF1α啟動子、與EF1α啟動子可操作地連接的SaCas9表達序列、tRNA編碼序列、與tRNA編碼序列可操作地連接的SaCas9對應的sgRNA、以及AAV2ITR 3'。

13.權利要求1的表達盒，其包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

14.一種重組載體，其包含權利要求1-13任一項的表達盒。

15.權利要求14的重組載體，其中所述載體是腺相關病毒載體。

16.一種試劑盒，其包含權利要求1至13任一項的表達盒或權利要求14至15任一項的重組載體。

17.一種基因編輯的方法，包括將權利要求1至13任一項的表達盒或權利要求14至15任一項的重組載體遞送至對象的細胞的步驟。