[發明專利]抗人PLGF單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201811053158.X
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109134650A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 唐靜;張偉;催叢叢
• 申請（專利權）人: 寧波奧丞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 劉曉暉

本發明公開了抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，包括動物免疫及脾細胞制備、骨髓瘤細胞的制備、飼養細胞的制備、細胞融合、細胞篩選、亞克隆、抗體純化、染色體分析等步驟；本發明通過將試驗過程、試驗材料進行優化，使其最適于PLGF單克隆抗體的制備，所制備的PLGF單克隆抗體具有效價高、親和力好，與PLGF抗原結合力強等優點，可用于免疫組化、免疫熒光、放射自顯影或其他方法來定性定位或定量檢測各種疾病如腫瘤或炎癥患者的組織器官中的PLGF表達水平，以輔助臨床診斷，同時PLGF單克隆抗體可作為PLGF蛋白的拮抗劑藥物成分，用于治療因血管過度增生而引起的多種疾病包括各種惡性腫瘤。

技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，具體涉及抗人PLGF單克隆抗體的制備方法。

背景技術

血管新生或增生(angiogenesis)在生物學上是指體內的已存在的血管(如毛細血管和小靜脈)通過出芽或分裂的方式而產生新的血管的過程。VEGF是目前已知的最強烈的刺激血管內皮細胞分裂增生的因子。VEGF一般常由血管內皮細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞所合成，并通過自分泌/旁分泌方式特異地作用于血管內皮細胞上的受體，而發揮促進血管內皮細胞生長、增殖、遷移、形成等作用。研究表明，在多數惡性腫瘤患者的癌組織中也能夠檢測到VEGF，且VEGF的表達水平增高與腫瘤惡性程度和疾病進展有關此外，VEGF在炎癥病理的血管中起著重要的作用。

PLGF與VEGF兩者同源，結構與生物活性相近，且都可與VEGFR1受體結合。但以往的研究更為關注的是VEGF，而對于PLGF，盡管其編碼基因早在1991年就已克隆出，但其在血管增生中的意義長時期以來一直是處于從屬或未定狀態。近年來隨著研究的深入，越來越多的結果證明PLGF實際上參與許多生理或病理條件下的血管增生。因此，需進一步研發出一種PLGF蛋白的單克隆抗體，可用于能夠快速、準確檢測人PLGF的免疫檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于提供抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，制備的抗體特異性好，親和力高，能夠用于PLGF免疫熒光檢測試劑盒，對人體內PLGF蛋白做出快速、準確的檢測。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA檢測法檢測血清中抗體效價，取效價高的小鼠免疫脾細胞；

(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞融合前1天，進行細胞換液并使骨髓瘤細胞在融合當天為對數生長階段；

(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，在無菌的條件下，取小鼠腹腔細胞，即飼養細胞，用5ml HAT培養基將飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*10⁵個/mL，將飼養細胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO₂培養箱中培養備用；

(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完畢，將融合細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，置37℃、含5％CO₂的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養液換液；

(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，選擇OD值高的雜交瘤細胞進行亞克隆；

(6)亞克隆：采用軟瓊脂法進行雜交瘤細胞的亞克隆，陽性孔繼續進行2-3次克隆化，直至100％雜交瘤細胞陽性率，最終得到高特異性PLGF雜交瘤細胞株，將高特異性PLGF雜交瘤細胞株液氮保存；