[發明專利]抗人PLGF單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201811053158.X
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109134650A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 唐靜;張偉;催叢叢
• 申請（專利權）人: 寧波奧丞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 劉曉暉

1.抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)動物免疫及脾細胞制備：采用BALB/c小鼠，將PLGF蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻成油包水的乳劑，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點注射小鼠，間隔3周，將PLGF蛋白尾靜脈注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA檢測法檢測血清中抗體效價，取效價高的小鼠免疫脾細胞；

(2)骨髓瘤細胞的制備：骨髓瘤細胞融合前1天，進行細胞換液并使骨髓瘤細胞在融合當天為對數生長階段；

(3)飼養細胞的制備：細胞融合前4天，在無菌的條件下，取小鼠腹腔細胞，即飼養細胞，用5ml HAT培養基將飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*10⁵個/mL，將飼養細胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO₂培養箱中培養備用；

(4)細胞融合：將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完畢，將融合細胞懸液加入已鋪有飼養細胞的96孔板中，置37℃、含5％CO₂的培養箱中培養，融合后第7天每孔用HAT完全培養液半換液，融合后第14天用HT完全培養基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養液換液；

(5)細胞篩選：細胞長至孔底1/10面積時，酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，選擇OD值高的雜交瘤細胞進行亞克隆；

(6)亞克隆：采用軟瓊脂法進行雜交瘤細胞的亞克隆，陽性孔繼續進行2-3次克隆化，直至100％雜交瘤細胞陽性率，最終得到高特異性PLGF雜交瘤細胞株，將高特異性PLGF雜交瘤細胞株液氮保存；

(7)抗體純化：將上述高特異性PLGF雜交瘤細胞經過濾離心處理后，再通過protein-A親合層析柱分離純化PLGF單克隆抗體，純化后，經SDS-PAGE測定PLGF單克隆抗體純度大于93％。

2.如權利要求1所述的抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，每次免疫時，小鼠的接種劑量為50或100ug/只。

3.如權利要求1所述的抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，飼養細胞的制備方法為通過頸脫位處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在無菌的條件下，用消毒剪掀起腹部皮膚，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，針頭留置在腹腔內，另一只手持75％酒精棉輕輕按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培養液，2000r/min離心5min，棄上清，用5ml HAT培養基將沉淀飼養細胞懸浮，調整飼養細胞濃度為2*10⁵個/mL，將上述飼養細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO₂培養箱中培養備用。

4.如權利要求1所述的抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，50％聚乙二醇PEG4000的加入量為1ml。

5.如權利要求1所述的抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，HAT完全培養液為98ml完全RPMI-1640培養基、1ml HT貯存液、1ml A貯存液的混合液，HT完全培養液為99ml完全RPMI-1640培養基、1ml HT貯存液的混合液。

6.如權利要求1所述的抗人PLGF單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，過濾膜的孔徑為0.22um，離心速度為1500rpm/min，離心時間為10min。