[發明專利]一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法

在審

• 申請號: 201811052581.8
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109180814A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 唐靜;張偉;陳星星;俞辰澤
• 申請（專利權）人: 寧波奧丞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N5/20
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 劉曉暉

本發明公開了一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，包括動物免疫、飼養層細胞的制備、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選及其克隆、單克隆抗體腹水制備及純化等方法，本發明AMH單克隆抗體的制備方法通過將制備過程中所用的材料及步驟進行優化，最終能得到高純度的AMH單克隆抗體，本發明所制備的AMH單克隆抗體具有效價高、親和力好，與AMH抗原結合力強等優點，可用于免疫組化、免疫熒光、放射自顯影或其他方法來定性定位或定量監測卵巢儲備力、預測體外受精聯合胚胎移植技術(IVF)的卵巢反應性、預防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)、男性生殖功能的評估等以輔助臨床診斷。

技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，具體涉及一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法。

背景技術

繆勒氏管激素(MIS)，也叫做抗繆勒氏管激素(AMH)，是由二硫化物橋連接兩個72kDa單體組成的140kU的糖蛋白二聚物,MIS/AMH屬于β-轉化生長因子(TGF-β)家族總科。AMH由睪丸未成熟的Sertoli細胞及出生后卵巢生長卵泡的顆粒細胞分泌,具有調節細胞發育及分化,使雄性胚胎繆勒氏管退化的作用。在男性，最初表達在8周胎兒睪丸支持細胞中，始于胚胎形成，并貫穿生命始終。在胚胎發育期間，AMH會引起繆勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道，對于女性而言，AMH是在36周胎兒期的卵泡顆粒細胞生成的，直至女性更年期，AMH逐漸下降至無法檢測的水平。

在臨床上可用于真假兩性畸形的診斷，腫瘤的特異性標記，精子形成的標記等,AMH已應用于主要用于監測卵巢儲備力、預測體外受精聯合胚胎移植技術(IVF)的卵巢反應性、預防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)、男性生殖功能的評估等。在多囊卵巢綜合征(PCOS)的診斷中也以此來代替竇卵泡數(AFC)指標。

婦女卵巢功能與年齡、基礎卵泡刺激素、基礎抑制素B、基礎雌二醇、氯米芬激發試驗、促性腺激素釋放激素激動劑激發試驗、竇卵泡數、卵巢體積和卵巢血流豐度以及抗繆勒氏管激素水平等多種因素相關，AMH為其中最敏感的指標。

傳統的AMH的檢測方法主要采用酶聯免疫吸附法、免疫熒光檢測法，而采用這些方法最關鍵的是獲得好用的抗繆勒氏管激素抗體。由于繆勒氏管激素在正常人血清中含量很低，因此對診斷用的抗繆勒氏管激素抗體，除了特異性高外，對親和力要求也非常高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，制備的抗體特異性好，親和力高，能夠用于AMH免疫熒光檢測試劑盒，對人體內AMH蛋白做出快速、準確的檢測，輔助確定婦女卵巢功能。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，包括如下步驟：

(1)動物免疫

免疫小鼠為6周齡體重18-20g的BALB/c雌性小鼠，免疫原為AMH重組蛋白，將免疫原與福氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射100ul/只，后間隔2周，將免疫原和福氏不完全佐劑充分乳化后，經背腹部皮下多點注射100ul/只，后間隔2周，小鼠進行眼球取血，檢測血清效價，取效價達到1:105的小鼠進行脾臟加強免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾細胞進行細胞融合；

(2)飼養層細胞的制備

取BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞和胸腺細胞作為飼養細胞，將BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精體表消毒后，用消毒后的剪刀和鑷子從后腹剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器取4ml DMEM培養基至腹腔，用手指輕輕擠壓腹部，并進行反復沖洗，回收沖洗液，取出小鼠的胸腺，將其碾碎后用DMEM培養基沖洗，回收洗液，將兩次回收液混合后，1200rpm/min離心3min，棄上清，即得到飼養層細胞；

(3)細胞融合