[發(fā)明專利]一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811052581.8 | 申請日： | 2018-09-10 |
| 公開（公告）號： | CN109180814A | 公開（公告）日： | 2019-01-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 唐靜;張偉;陳星星;俞辰澤 | 申請（專利權(quán)）人： | 寧波奧丞生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K16/26 | 分類號： | C07K16/26;C12N5/20 |
| 代理公司： | 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616 | 代理人： | 劉曉暉 |
| 地址： | 315000 浙江省寧*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 單克隆抗體 制備 抗體制備 激素 卵巢 男性生殖功能 胚胎移植技術(shù) 放射自顯影 飼養(yǎng)層細胞 雜交瘤細胞 定量監(jiān)測 動物免疫 臨床診斷 卵巢儲備 卵巢反應(yīng) 免疫熒光 免疫組化 體外受精 細胞融合 制備過程 高純度 結(jié)合力 綜合征 腹水 抗原 可用 效價 親和力 定性 克隆 篩選 刺激 評估 預(yù)測 預(yù)防 優(yōu)化 聯(lián)合 | ||
1.一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)動物免疫
將免疫原與福氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，在免疫小鼠背腹部皮下多點注射100ul/只，后間隔2周，將免疫原和福氏不完全佐劑充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點注射100ul/只，后間隔2周，小鼠進行眼球取血，檢測血清效價，取效價達到1:105的小鼠進行脾臟加強免疫，腹腔注射免疫原100uL/只，3天后取小鼠脾細胞進行細胞融合；
(2)飼養(yǎng)層細胞的制備
取BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞和胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞，將BALB/c小鼠眼球放血致死，75％酒精體表消毒后，用消毒后的剪刀和鑷子從后腹剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器取DMEM培養(yǎng)基至腹腔，用手指輕輕擠壓腹部，并進行反復(fù)沖洗，回收沖洗液，取出小鼠的胸腺，將其碾碎后用DMEM培養(yǎng)基沖洗，回收洗液，將兩次回收液混合后，1200rpm/min離心3min，棄上清，即得到飼養(yǎng)層細胞；
(3)細胞融合
取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞在無血清的DMEM培養(yǎng)基中混勻，1300rpm離心3min，去除上清，37℃水浴中加入1mL 50％PEG-1500并融合1min，用無血清的DMEM培養(yǎng)基終止融合后1300rpm離心3min，棄去上清，得到融合細胞，融合細胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細胞的細胞板中，置于37℃，含5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細胞的篩選及其克隆
5天后，等到融合細胞覆蓋孔底10-30％時，用常規(guī)間接ELISA方法篩選分泌抗體的陽性孔，即以AMH重組蛋白為抗原，用CBS緩沖液(50mM,pH＝9.5)稀釋到0.5ug/ml包被96孔酶標(biāo)板，50ul/孔，4℃包被過夜，拍干后，用封閉液200ul/孔的量封閉，37℃封閉2小時，拍干備用；將待檢細胞培養(yǎng)上清50ul/孔加入上述ELISA板中，于37℃反應(yīng)30min后洗滌并拍干，洗滌液PBS緩沖液(50mM,pH＝7.2)，加入50ul/孔的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，于37℃孵育30min后洗滌并拍干，加入50ul/孔的TMB顯色液，于37℃避光顯色10min,加入25ul/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)，并于OD450處讀取數(shù)值,陽性孔的確定原則：OD450值/陰性對照值≥2.1,選擇呈強陽性反應(yīng)的細胞孔，采用有限稀釋法克隆，克隆多次，待AMH單克隆細胞株陽性率100％即確定為穩(wěn)定雜交瘤細胞株，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存；
(5)單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右KM雌性小鼠，腹腔注射石蠟，7-10天后腹腔注入雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，注射針頭采集腹水，2000rpm離心3min，收集上清液即為單抗腹水,取1倍體積單抗腹水加2倍體積醋酸緩沖液(60mM，pH＝4.8)稀釋，4℃靜置1h，2000rpm離心20min，收集上清，再用50％飽和硫酸銨沉淀單抗，4℃放置2h，3000rpm離心20min，棄去上清，沉淀用2倍體積的PBS緩沖液(50mM,pH＝7.2)溶解，在4℃流動透析24h后即獲純化的AMH單克隆抗體，-70℃保存。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，其特征在于，步驟(1)中，免疫小鼠為6周齡的BALB/c雌性小鼠，免疫原為AMH重組蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，其特征在于，步驟(2)中，以體積份數(shù)計，DMEM培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基80份、小牛血清20份。
4.如權(quán)利要求1所述的一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，其特征在于，步驟(2)中，DMEM不完全培養(yǎng)基包括DMEM 13.37g、去離子水980ml、NaHCO3 3.7g、青霉素0.1g、鏈霉素0.1g、L-谷氨酰胺0.2g。
5.如權(quán)利要求1所述的一種抗繆勒氏管激素的抗體制備方法，其特征在于，步驟(4)中，封閉液為含1％BSA的PBS緩沖液(50mM,pH＝7.2)。
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