[發明專利]標記外泌體的方法和AIE熒光分子標記的外泌體及其應用

有效

• 申請號: 201811051433.4
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109395096B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王悅冰;曹紅梅;岳志偉;丁丹;李宗金
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;C12N5/0775
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超;蘇瑞

本公開涉及一種標記外泌體的方法和AIE熒光分子標記的外泌體及其應用，該方法包括：將含有AIE熒光分子的標記溶液與外泌體混合后進行熒光標記。本公開利用特定的聚集誘導發光熒光分子穩定高效地對外泌體進行標記，不改變外泌體的結構和組成成分，不影響其生物功能，所得到的標記后的外泌體可用于制備示蹤藥物，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。

技術領域

本公開涉及生物技術領域，具體地，涉及一種標記外泌體的方法和AIE熒光分子標記的外泌體及其應用。

背景技術

外泌體是由活細胞分泌的直徑約30-100nm的具有雙層膜結構的納米級細胞外囊泡，天然存在于血液、唾液、尿液和母液等各種體液中。外泌體作為細胞外囊泡的重要組成部分，已成為細胞間通訊的重要形式，其所介導的細胞間通訊可以為鄰近細胞提供大量的生物活性信號分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白質等。被釋放至細胞外的外泌體可以通過不同的途徑進入靶細胞內，發揮其生物學功能。第一，外泌體可以通過與靶細胞膜表面受體結合，觸發靶細胞內的信號轉導通路，并進一步調節靶細胞內的生物學過程；第二，外泌體可以被靶細胞內在化，這一過程依賴于網格蛋白介導的內吞作用、脂筏介導的內吞作用及胞飲作用等；第三，外泌體可以通過與靶細胞膜融合，直接將外泌體內攜帶的活性物質遞送到靶細胞內。

隨著細胞生物學和醫學前沿交叉領域的不斷發展，外泌體的研究逐漸深入，越來越多的研究證明外泌體在疾病治療中展現出令人振奮的治療效果。如間充質干細胞來源的外泌體通常被認為具有與間充質干細胞相似的功能，包括促進組織損傷修復、抑制炎癥反應及減輕組織纖維化程度等。但是，在利用外泌體進行治療前，首先要闡明外泌體在體內的生物分布和在細胞中的最終命運。所以迫切需要一種標記方法實現對外泌體的體外標記和活體示蹤，從而實現在不影響其功能的前提下可視化外泌體，有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。

目前為止已有多種標記外泌體的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表現在破壞外泌體的膜結構、改變外泌體的組成成分、影響外泌體的功能。例如熒光蛋白報告系統和熒光素酶報告系統通過構建CD63或Gluc過表達的穩定細胞系而產生具有CD63-GFP或Gluc-GFP標記的外泌體，所以這些細胞產生的外泌體的組成成分已經發生改變，而且CD63在外泌體的生物發生和功能中是一種重要的蛋白，也影響了外泌體的功能。通過修飾外泌體的結構、利用外泌體表面的巰基和通過放射性核素標記外泌體則破壞或改變了外泌體的膜結構，改變了其物理性質從而影響外泌體的功能。而最常用的各種熒光染料，卻具有很高的淬滅系數，導致其半衰期短且易淬滅，而且它們可以在與外泌體相似的水溶液中形成染料聚集體，導致在外泌體的攝取實驗中帶來誤差。

發明內容

本公開的目的是提供一種標記外泌體的方法和AIE熒光分子標記的外泌體及其應用，該方法不改變外泌體的結構和組成成分，也不影響外泌體的生物功能。

為了實現上述目的，本公開第一方面：提供一種標記外泌體的方法，該方法包括：將含有AIE熒光分子的標記溶液與外泌體混合后進行熒光標記，其中，所述AIE熒光分子的結構式為：

可選地，以含有100μg蛋白質的外泌體為基準，所述AIE熒光分子的用量為1～8nmol。

可選地，所述標記溶液為AIE熒光分子與緩沖液的混合物，所述AIE熒光分子的終濃度為1～8μmol/L。

可選地，所述緩沖液為PBS、Na-HEPES、HEPES或生理鹽水。

可選地，所述熒光標記的條件為：溫度為4～37℃，時間為2～3h。

可選地，所述外泌體為來源于干細胞的外泌體，所述干細胞包括脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、胎盤間充質干細胞、尿液來源干細胞、內皮祖細胞和心臟干細胞中的一種或多種。