[發(fā)明專利]長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811051423.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN109134541B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭誠(chéng);常燕強(qiáng);盧亞明;張茂華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伯科生物醫(yī)學(xué)科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C07F9/6561;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京科石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11595
• 代理人: 高元吉

本發(fā)明公開長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物及其制備方法和用途。本發(fā)明的長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物包括生物素分子、間隔臂和反應(yīng)基團(tuán)。其中，生物素分子包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)和戊酸側(cè)鏈，間隔臂具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)基團(tuán)具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)，生物素分子中的戊酸側(cè)鏈與間隔臂第一末端的NH連接，間隔臂的第二末端的氧與反應(yīng)基團(tuán)的磷結(jié)合形成O?P鍵，從而將間隔臂與反應(yīng)基團(tuán)連接。本發(fā)明的長(zhǎng)鏈生物標(biāo)記物可用于基因的捕獲測(cè)序。?NH(CH₂)_mO?(?C＝O?NH?(CH₂?CH₂O?)₄)_n式(I)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于基因測(cè)序的生物標(biāo)記物，具體涉及用于基因測(cè)序，特別是二代測(cè)序的長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

二代測(cè)序在分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中起到越來(lái)越重要的作用。其中，目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序是二代測(cè)序應(yīng)用中性價(jià)比非常高的手段，在遺傳性疾病和腫瘤科學(xué)研究及臨床診斷領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用空間。其原理是針對(duì)感興趣的基因組區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的互補(bǔ)探針，將其與基因組DNA進(jìn)行雜交，富集目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA片段，然后進(jìn)行高通量測(cè)序。

捕獲富集的關(guān)鍵步驟是把生物素修飾的單鏈DNA作為捕獲試劑，抓到基因組中感興趣的目標(biāo)區(qū)域，然后利用鏈霉親合素(streptavidin，SA)和生物素的天然特異性結(jié)合能力，與SA修飾的磁珠結(jié)合，在磁場(chǎng)中分離出來(lái)。

根據(jù)雜交時(shí)的狀態(tài)可將區(qū)域捕獲分為固相雜交法和液相雜交法。固相雜交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上，例如基因芯片。雜交后先洗脫未雜交上的DNA片段，再將與探針雜交的DNA洗脫下來(lái)。現(xiàn)在更加流行的是液相雜交。與固相雜交最大的差異的是液相雜交在溶液中使目標(biāo)DNA片段和帶有生物素標(biāo)記的探針直接雜交。目前采用該技術(shù)公司包括主要是國(guó)外生物科技公司。如安捷倫、羅氏、賽默飛等等。

現(xiàn)有的生物素修飾可通過(guò)加入生物素修飾的dUTP(Deoxyuridine Triphosphate脫氧尿苷三磷酸)進(jìn)行復(fù)制的方法隨機(jī)摻雜在DNA鏈上。生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)。生物素分子有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中咪唑酮環(huán)是與親和素結(jié)合的主要部位；另外一個(gè)噻吩環(huán)的C2上有一戊酸側(cè)鏈，可以提供一定的空間距離，但是這種側(cè)鏈長(zhǎng)度并不足夠。因此，生物素和DNA一般通過(guò)有機(jī)長(zhǎng)鏈狀分子連接，從而調(diào)節(jié)其距離。通常采用的有己烷鏈、三甘醇(TEG)鏈或者其他長(zhǎng)度的鏈等，例如，DNA復(fù)制時(shí)摻入的Biotin-16-dUTP(CASnumber 136632-31-0)采用了16個(gè)原子長(zhǎng)度的有機(jī)分子鏈。然而，這些有機(jī)長(zhǎng)鏈并不能完全滿足當(dāng)前的需求，特別是在二代測(cè)序方面的需求。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明研究了生物素分子和寡核苷酸之間的有機(jī)長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于二代測(cè)序中的探針捕獲的影響，發(fā)現(xiàn)具有特定結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈生物素分子特別適合于二代測(cè)序，并且在特定鏈長(zhǎng)范圍內(nèi)，捕獲效率逐步提高。至少部分地基于上述內(nèi)容完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

本發(fā)明的第一方面，提供一種長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物，其包括生物素分子、間隔臂和反應(yīng)基團(tuán)，其中，所述生物素分子包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)和戊酸側(cè)鏈，所述間隔臂具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)，所述反應(yīng)基團(tuán)具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)，所述生物素分子中的戊酸側(cè)鏈與間隔臂第一末端的NH連接，所述間隔臂的第二末端的氧與所述反應(yīng)基團(tuán)的磷結(jié)合形成O-P鍵，從而將所述間隔臂與所述反應(yīng)基團(tuán)連接，

-NH(CH₂)_mO-(-C＝O-NH-CH₂-CH₂O)_n- 式(I)

式(I)中m和n分別獨(dú)立地表示1-10的整數(shù)，

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的長(zhǎng)鏈生物素標(biāo)記物中的生物素分子受DMT基團(tuán)保護(hù)。