[發(fā)明專利]長鏈生物素標記物及其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811051423.0
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109134541B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設計）人: 郭誠;常燕強;盧亞明;張茂華
• 申請（專利權(quán)）人: 伯科生物醫(yī)學科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C07F9/6561;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京科石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11595
• 代理人: 高元吉

1.長鏈生物素標記物在制備用于二代測序的捕獲探針中的用途，其特征在于，所述長鏈生物素標記物包括生物素分子、間隔臂和反應基團，其中，所述生物素分子包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)和戊酸側(cè)鏈，所述間隔臂具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)，所述反應基團具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)，所述生物素分子中的戊酸側(cè)鏈與間隔臂第一末端的NH連接，所述間隔臂的第二末端的氧與所述反應基團的磷結(jié)合形成O-P鍵，從而將所述間隔臂與所述反應基團連接，

-NH(CH₂)_mO-(-C＝O-NH-(CH₂-CH₂O-)₄)_n 式(I)

式(I)中m為4-8的整數(shù)，且n為2-3的整數(shù)，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述生物素分子受DMT基團保護。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述長鏈生物素標記物通過包括下述步驟的制備方法獲得：

(1)在吡啶溶液中，使生物素和DMT-Cl反應得到中間產(chǎn)物A；

(2)在無水二甲基甲酰胺中，使中間產(chǎn)物A與氨基己醇反應得到中間產(chǎn)物B；

(3)在無水乙腈中，用氯甲酸對硝基苯酚酯活化中間產(chǎn)物B，之后與氨基-PEG3-醇反應得到中間產(chǎn)物C1，以該中間產(chǎn)物C1代替中間產(chǎn)物B再次重復該步驟n-1次，得到中間產(chǎn)物Cn，其中n的含義與式(I)中的含義相同；

(4)在無水乙腈中，使中間產(chǎn)物Cn在四氮唑作用下與磷試劑反應得到長鏈生物素標記物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中步驟(2)中使用二琥珀酰亞胺基碳酸酯作為催化劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中步驟(4)中的磷試劑為2-氰乙基-N,N,N’N’-四異丙基亞磷酰二胺。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的用途，其中所述長鏈生物素標記物結(jié)合至寡核苷酸序列5’端羥基，從而形成捕獲探針。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中，所述捕獲探針通過下述制備方法獲得：

(1’)由多個核苷酸合成寡核苷酸序列的步驟；和

(2’)長鏈生物素標記物結(jié)合步驟，其包括使用四氮唑混合活化長鏈生物素標記物，然后使其與步驟(1’)得到的寡核苷酸序列5’端最后一個堿基上的羥基進行反應；然后進行氧化和去DMT保護。