[發明專利]用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的特異性引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201811050683.6
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109055531A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 林志鏗;周曉光;李運濤;楊璐平;雷洋;王松林
• 申請（專利權）人: 廈門為正生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 周學玲

1.一種用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的特異性引物組及探針，其特征在于，所述基因多態性位點為MTHFR(C677T)、MTHFR(A1298C)、MTRR(A66G)，所述引物組及探針序列為：

M677正向引物F1：5’-GAGCTTTGAGGCTGACCTGA-3’；

M677反向引物R1：5’-TGATGCCCATGTCGGT-3’；

M1298正向引物F2：5’-AGCAAGTCCCCCAAGG-3’；

M1298反向引物R2：5’-ATTCCGGTTTGGTTCTCCCG-3’；

M66正向引物F3：5’-TCAGTTTCACTGTTACATGCCTTG-3’；

M66反向引物R3：5’-CACTGTAACGGCTCTAACC-3’；

M677探針P1：5’-AGCCGATTTCATCATCACGCATTCCCGGCT-3’；

M1298探針P2：5’-AGAAAGTGTCTTTGAAGTCTTTTCGTTTCT-3’；

M66探針P3：5’-ATATGTGAGCAAGCTGTGGTAAAGCCATAT-3’。

2.一種用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液凍干粉，所述的PCR反應液凍干粉包含如權利要求1所述的M677正向引物F1、M677反向引物R1、M677探針P1、M1298正向引物F2、M1298反向引物R2、M1298探針P2、M66正向引物F3、M66反向引物R3、M66探針P3的混合物；所述PCR反應液凍干粉還包括10×SSP buffer、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP)、Taq酶、MgCl₂、海藻糖。

3.如權利要求2所述的用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應管凍干粉在加入DNA溶解液后的成分終濃度為：0.125μM的M677正向引物F1、1.25μM的M677反向引物R1、0.125μM的M1298正向引物F2、1.25μM的M1298反向引物R2、0.125μM的M66正向引物F3、1.25μM的M66反向引物R3、0.25μM的M677探針P1、0.25μM的M1298探針P2、0.25μM的M66探針P3、0.05mM的dATP、0.05mM的dTTP、0.05mM的dCTP、0.05mM的dGTP、0.05mM的dUTP、3.75mM的MgCl2、5U/μL的Taq酶、10％海藻糖。

4.如權利要求2所述的用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述的DNA溶解液的組成：10mMTris-HCl(pH 8.5)，1mM EDTA。

5.如權利要求2所述的用于檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的試劑盒，其特征在于，還包括野生型對照、陰性對照，所述野生型對照為MTHFR(C677T)、MTHFR(A1298C)、MTRR(A66G)三個基因位點野生型質粒混合物；所述陰性對照為1*TE緩沖液或無核酸酶水作為空白對照。

6.如權利要求2所述的用于同時檢測人MTHFR和MTRR基因多態性位點的試劑盒，其特征在于，所述反應液凍干粉的儲存條件為2-30℃避光保存。

7.一種如權利要求5所述的試劑盒用于人MTHFR和MTRR基因多態性位點的檢測方法，其特征在于，從血液、唾液直接通過PCR方法擴增人MTHFR(C677T)、MTHFR(A1298C)、MTRR(A66G)三個多態性位點，包括如下步驟：

步驟一：直接取待檢測的全血、唾液作為PCR模板；

步驟二：從試劑盒中取出含有PCR反應液凍干粉的PCR管，加入DNA溶解液后形成PCR反應液，將所述PCR反應液與適量的全血或唾液混勻；

步驟三：進行PCR擴增反應：50℃孵育2分鐘；95℃變性10分鐘；10個循環：95℃15秒，65℃20秒(每個循環下降1℃)，72℃20秒，50個循環：95℃15秒，55℃20秒，72℃20秒，熔解曲線階段：95℃1分鐘，35℃3分鐘，40℃-72℃(升溫速率0.04℃/s)；

步驟四：PCR結果判定：在所述試劑盒的野生型對照和空白對照品符合規定的情況下，通過比較待測樣本在檢測體系中共三個檢測通道(分別為FAM、HEX、ROX通道)與野生型對照之間熔點(Tm值)的差異判斷樣本的人MTHFR和MTRR基因多態性的基因型。