[發明專利]一種干細胞外泌體、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201811049325.3
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109097336A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 刁波;張宜;劉瑩;楊前;王剛;陳力;袁紫林;林虹;羅青云;袁賢玲
• 申請（專利權）人: 深圳市新一侖生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;A61K8/98;A61Q19/00
• 代理公司: 武漢今天智匯專利代理事務所(普通合伙) 42228
• 代理人: 鄧寅杰

1.一種干細胞外泌體，其特征在于，所述干細胞外泌體由含有改善皮膚的靶基因載體的間充質干細胞分泌，所述靶基因載體包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一種或多種基因。

2.一種制備權利要求1所述干細胞外泌體方法，其特征在于，首先對用戶肌膚問題進行關于皮膚的基因檢測，根據基因檢測的結果，尋找到改善其肌膚問題的目的基因，通過體外合成手段對所述目的基因進行擴增，然后將目的基因轉至載體制備成靶基因載體，將所述靶基因載體轉染進間充質干細胞得到靶基因間充質干細胞，最后將所述靶基因間充質干細胞進行培養，收集其細胞培養液，提取所述細胞培養液中的外泌體，將提取好的外泌體進行滅菌、定量后分裝保存；

所述測試的基因如下中的一種或多種基因組合：

與青春痘形成的相關基因組合：EDAR、CYP21A2、KIF3A、OVOL1、ATP2A2；

皮膚防曬能力的相關基因組合：MC1R、OCA2 、SOD1、CYP21A2、KIF3A、OVOL1；

皮膚抗敏性的相關基因組合：COL5A1、MC1R、KIF3A、OVOL1、SOD1；

與雀斑黑色素形成相關的基因組合：MC1R、OCA2、BNC2、TYR；

抗皺能力的相關的基因組合：SOD1、GHRHR、EDAR、FLG、MC1R、MMP9；

與皮膚防輻射能力及抗衰老能力相關的基因組合：XRCC1、RAD51、HBE1、MMP9、SOD1、CHRHR、KL。

3.根據權利要求2所述一種干細胞外泌體制備方法，其特征在于，所述目的基因包括KIF3A、OVOL1、SOD1、COL5A1、MC1R、TYR、GHRHR、EDAR、FLG、MMP9、XRCC1、RAD51、HBE1或KL中的一種或多種。

4.根據權利要求3所述一種干細胞外泌體制備方法，其特征在于，所述干細胞外泌體制備方法包括以下步驟：

（1）將間充質干細胞進行傳代培養，從中篩選出細胞狀態良好、增殖能力強的間充質干細胞；

（2）將所述目的基因進行擴增，并加入酶切位點，裝入載體，得到靶基因載體，將所述靶基因載體轉至步驟（1）所述間充質干細胞，得到靶基因間充質干細胞；

（3）將步驟（2）中選取的間充質干細胞使用ɑ-MEM空培養基進行培養，培養一段時間后，去除雜質，分離出培養上清液；

（4）將步驟（3）所述培養上清液與Total exosome Isolation外泌體提取液混合后進行孵育，孵育后得第一孵化液，對第一孵化液進行離心濃縮，得到含外泌體的濃縮液；

（5）將步驟（4）所述含外泌體的濃縮液加入無菌PBS溶解后加入Total exosomeIsolation外泌體提取液進行孵育，孵育后得第二孵化液，將第二孵化液進行離心收集底部沉淀，得間充質干細胞分泌的外泌體。

5.根據權利要求4所述一種干細胞外泌體制備方法，其特征在于，所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞、骨髓間充質干細胞或外周血間充質干細胞中的一種。

6.根據權利要求2所述一種干細胞外泌體制備方法，其特征在于，所述載體為質粒，所述靶基因載體轉染方法為lipo2000轉染法或電轉法。

7.根據權利要求4所述一種干細胞外泌體制備方法，其特征在于，所述干細胞外泌體制備方法步驟（3）通過以下步驟完成：

步驟3A: 將不含外泌體血清的空白干細胞ɑ-MEM培養基加入步驟（2）所述篩選的靶基因間充質干細胞中,24小時至48小時后收取細胞培養上清液即為條件培養基；

3B：將步驟3A中所述條件培養基在4℃，2000g條件下離心30min，棄去沉淀雜質，收集上層液體，即培養上清液。