[發明專利]一種用于擴增日本鰻鱺干擾素相關因子的引物和制備方法

在審

• 申請號: 201811049120.5
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN110129329A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 梁英;李想;黃文樹;黃貝;徐繼松;翟少偉
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/23
• 分類號: C12N15/23;C12N15/11;C12N15/70;C07K14/57;C07K1/22
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明公開了一種用于擴增日本鰻鱺干擾素相關因子的引物和制備方法。所述引物如SEQ ID NO:3?4所示。本發明通過引物PCR擴增獲得日本鰻鱺IFN?γrel基因序列，構建pET32a原核表達載體，轉化到大腸桿菌培養，通過誘導條件的優化，可大量表達日本鰻鱺IFN?γrel重組蛋白，通過鎳柱純化并優化純化條件獲得高純度高質量的蛋白。

技術領域

本發明涉及基因工程重組領域，尤其涉及一種用于擴增日本鰻鱺干擾素相關因子的引物和制備方法。

背景技術

干擾素(IFN)是一類由病毒誘導產生具有抗病毒作用的細胞因子。根據其序列特征和功能差異，哺乳動物干擾素分為I型、II型和III型三大類。I型干擾素主要包括IFN-α/IFN-β等。II型干擾素(Interferon，IFN)，即IFN-γ，是一類二聚化的可溶性細胞因子，主要由T淋巴細胞和NK細胞分泌，具有抗病毒和免疫調節作用。III型干擾素即IFN-λ，由IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4組成。

在哺乳動物中，II型干擾素只有一種類型，即IFN-γ，由一個基因編碼，包含有4個外顯子和3個內含子。與哺乳動物不同的是，魚類的II型干擾素存在兩個IFN-γ基因(IFN-γ1和IFN-γ2)，與哺乳動物同源的IFN-γ命名為IFN-γ2，而IFN-γ1由于與高等脊椎動物同源性很低，所以又被命名為干擾素相關因子(IFN-γrel，IFN-related molecule)。IFN-γrel首次在斑馬魚(Danio rerio)和綠河豚(Tetraodon nigirovirdis)中被發現。隨后在大西洋鮭(Salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉(Cyprinus carpio)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、金魚(Carassius auratus)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、日本鯽(Carassius auratus langsdorfii)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)等中均鑒定出兩個IFN-γ基因。已有的研究表明，二者的結構、功能、信號轉導存在差異：(1)結構：與IFN-γ不同，IFN-γrel基因的C端缺乏核定位信號(NLS)結構域，這使其喪失了誘導趨化因子的能力。與其他魚類的IFN-γrel相似，日本鰻鱺IFN-γrel的C-端也缺乏NLS；(2)功能：在免疫原刺激下，斑馬魚IFN-γ和IFN-γrel基因在各組織中的表達水平有所不同，表明其功能可能存在差異。在鯉中發現IFN-γrel主要由IgM⁺細胞產生，而IFN-γ主要在IgM^－細胞中檢測到，表明IFN-γrel主要調控體液免疫應答。IFN-γrel處理金魚單核細胞后，可引起CXCL-8，IL-1β表達上調，而這些基因對IFN-γ的刺激無應答。金魚IFN-γ能產生持久的反應氧中間體(Reactive Oxidant Intermediates，ROI)效應，而IFN-γrel只能產生短暫的ROI效應隨后快速下調。(3)信號轉導：有研究顯示硬骨魚類的兩個IFN-γ基因分別有其特異性的受體而不是共用相同的受體。在斑馬魚及金魚中發現了2個IFNGR1基因，即IFNγR1-1/CRFB17和IFNγR1-2/CRFB13，它們能分別和不同的II型干擾素配體結合。金魚的IFNγR1-1特異性結合IFN-γrel，IFNγR1-2特異性結合IFN-γ。Grayfer等發現IFN-γ能誘導金魚單核細胞中IRF1和IRF8表達上調，而IFN-γrel卻不能。此外，IFN-γrel與IFN-γ都能誘導STAT1的磷酸化，但是STAT1的核定位僅發生在IFN-γ處理過的單核細胞內，這說明金魚IFN-γrel的細胞信號途徑可能不同于IFN-γ。