[發明專利]建立時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒

在審

• 申請號: 201811048834.4
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109239334A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 劉斌;李寶民;關恒;張蕾;劉戈;趙青;史永豐;劉寧;李添偉;隋寶珍;張金玲;仇淑園;孫凈;黃景林;高敏;孫曉婷;林林;朱道林;孫玉峰;王賀
• 申請（專利權）人: 吉林大學;長春恒曉生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/533
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

一種建立時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，屬于基因重組及蛋白制備技術領域。本發明的目的是用SF9細胞表達Flag?MxA，純化出MxA蛋白，作為校準品。制備時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試紙卡，用時間分辨熒光免疫法分析儀測定試紙卡熒光強度，進一步獲得樣品中MxA濃度的建立時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒。本發明包括試紙卡和低滲溶液；在底板上順次相互搭接經過處理的樣品墊、吸附有MxA抗體?熒光微球的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙板，然后切割成3?5mm寬的試紙條，將試紙條裝入塑料外殼形成試紙卡。本發明采用昆蟲細胞系統表達MxA，昆蟲細胞近似于人體細胞，但產量高，成本低，能大量生產。

技術領域

本發明屬于基因重組及蛋白制備技術領域。

背景技術

感染性疾病是指由致病微生物（細菌、病毒、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體、真菌等）通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病，其中最常見是細菌和病毒感染，需要快速診斷細菌或病毒感染，指導臨床治療方向。臨床上常用檢測血清中降鈣素原（ Procalcitonin ,PCT）指標，來快速診斷細菌感染發生，指導抗細菌感染治療。目前，還沒有一個血液學指標能診斷病毒感染發生，需要尋找判定病毒感染血液指標，而血液中單核細胞產生粘病毒抗性基因蛋白A(Myxovirus resistance protein A，MxA）有潛力作為病毒感染指標,用于早期診斷病毒感染發生。

MxA是血液單核細胞質中蛋白，MxA基因位于21 號染色體長臂遠端(21q22), 經IFN-α/β處理細胞，誘導產生78KDa MxA蛋白，MxA屬于大GTP酶的動態蛋白(dynamin)超家族成員，MxA的特征是相對高分子量,自我聚合傾向,相對比較低GTP親和力和高GTP水解速率，不同種群MxA蛋白間的同源性很高。

MxA蛋白主要由3個區域組成:(1)N端GTPase結構域,由約300個氨基酸組成,是GTP酶活性區,包含3個 GTP結合基序，1個自我組裝區;(2)中央相互作用結構域:約含有150個氨基酸; (3)C端GTPase效應結構域,約含有100個氨基酸,其中含2個亮氨酸拉鏈結構, 形成分子雙螺旋結構。

發明內容

本發明的目的是用SF9細胞表達Flag-MxA，純化出MxA蛋白，作為校準品。制備時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試紙卡，用時間分辨熒光免疫法分析儀測定試紙卡熒光強度，進一步獲得樣品中MxA濃度的建立時間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒。

本發明包括試紙卡和低滲溶液；在底板上順次相互搭接經過處理的樣品墊、吸附有MxA抗體-熒光微球的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙板，然后切割成3-5mm寬的試紙條，將試紙條裝入塑料外殼形成試紙卡。

本發明硝酸纖維素膜上包被有MxA抗體形成檢測線和抗IgG抗體形成質控線。

本發明熒光微球表面修飾官能團為羧基、羥基或環氧基的一種，直徑為100-500nm；根據權利要求1所述的熒光微球標記鑭系元素螯合物，包括銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)螯合物中一種；進一步優選為銪螯合物(Europium Chelate)，激發波長是420nm，發射波長是615nm。

本發明低滲溶液是Tris,磷酸鹽，碳酸鹽緩沖液，鹽濃度低于10mm,含0.1-0.5%NP-40, 用于裂解細胞，釋放出細胞內的蛋白。

本發明所用時間分辨熒光免疫層析（TRFIA）分析儀，波長350-430nm激發光作用后，延時100-400uS，再測定波長600-650nm熒光強度。