[發(fā)明專利]建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811048834.4
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109239334A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉斌;李寶民;關(guān)恒;張蕾;劉戈;趙青;史永豐;劉寧;李添偉;隋寶珍;張金玲;仇淑園;孫凈;黃景林;高敏;孫曉婷;林林;朱道林;孫玉峰;王賀
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué);長春恒曉生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/533
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

1.一種建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：包括試紙卡和低滲溶液；在底板上順次相互搭接經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有MxA抗體-熒光微球的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙板，然后切割成3-5mm寬的試紙條，將試紙條裝入塑料外殼形成試紙卡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：硝酸纖維素膜上包被有MxA抗體形成檢測線和抗IgG抗體形成質(zhì)控線。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：熒光微球表面修飾官能團(tuán)為羧基、羥基或環(huán)氧基的一種，直徑為100-500nm；根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記鑭系元素螯合物，包括銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)螯合物中一種；進(jìn)一步優(yōu)選為銪螯合物(Europium Chelate)，激發(fā)波長是420nm，發(fā)射波長是615nm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：低滲溶液是Tris,磷酸鹽，碳酸鹽緩沖液，鹽濃度低于10mm,含0.1-0.5%NP-40, 用于裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：所用時(shí)間分辨熒光免疫層析（TRFIA）分析儀，波長350-430nm激發(fā)光作用后，延時(shí)100-400uS，再測定波長600-650nm熒光強(qiáng)度。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：MxA抗體-熒光微球，選用鑭系元素螯合物熒光標(biāo)記羧基修飾微球，用碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)處理羧基修飾熒光微球后，MxA抗體偶聯(lián)到上述熒光微球上，MxA抗體與熒光微球重量比為1：50-1：5，用噴膜儀將MxA抗體-熒光微球噴涂于結(jié)合墊上，干燥后，封存?zhèn)溆谩?/p>

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：制備MxA校準(zhǔn)品：用PCR從pCS6-MX1擴(kuò)增出MxA DNA（核酸序列1-1989），構(gòu)建pFastBac-Flag-MxA載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)到HD10Bac 細(xì)菌中，產(chǎn)生重組Flag-MxA AcNPV（昆蟲病毒）質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)導(dǎo)此質(zhì)粒進(jìn)到昆蟲細(xì)胞（SF9細(xì)胞），產(chǎn)生重組Flag-MxA AcNPV；此病毒感染SF9細(xì)胞后，表達(dá)出Flag-MxA蛋白；用Anti-Flag 抗體親和層析法純化出Flag-MxA蛋白，此純化Flag-MxA蛋白作為校準(zhǔn)品。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測MxA試劑盒，其特征在于：Flag-MxA為校準(zhǔn)品，用TRFIA分析儀測定不同濃度MxA校準(zhǔn)品試紙卡檢測線上呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度，制備MxA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立MxA濃度標(biāo)準(zhǔn)卡，輸入到TRFIA分析儀，建立TRFIA分析儀自動(dòng)顯示樣品中MxA濃度檢測系統(tǒng)。