[發明專利]一種整合型酵母重組表達系統及使用方法

在審

• 申請號: 201811048701.7
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109266564A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 華權高;沈鶴霄;李昆鵬;鄧文鵬;田甜甜;杜麗娜
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12R1/865;C12R1/85
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 王俊杰

一種整合型酵母重組表達系統及使用方法，該酵母為URA3基因缺陷型，并含表達URA3基因且整合到酵母基因組的載體。該方法目的在于構建得到URA3基因改造的基因缺陷型貝酵母菌株作為遺傳轉換的篩選標記，同時也為PYIP5的轉化提供可以用于整合遺傳的整合位點。改變了目前酵母表達中普遍遇到的附加型整合方式帶來的遺傳傳代不穩定，以及導致高密度發酵的時候質粒丟失產生不表達的現象。該表達系統適用于多種酵母。經過驗證該酵母整合方式傳代300代均能穩定遺傳，且高密度發酵中可以節省90％的培養基成本。

技術領域

本發明涉及重組蛋白表達領域，具體涉及一種整合型酵母重組表達系統及使用方法。

背景技術

酵母是低等的單細胞真核模式生物，已完成基因組測序，遺傳背景清晰，具有生長繁殖快，成本低，易于實現高密度培養和大規模發酵的優點。目前發展成熟的酵母表達系統主要包括釀酒酵母表達系統和畢赤酵母表達系統。

畢赤酵母表達系統具有操作簡便、遺傳穩定、表達量高、對目的蛋白質進行糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾功能，使表達的重組蛋白具有同天然蛋白相似的生物學功能，在非糖活性蛋白生產上具有顯著優勢。雖然釀酒酵母表達相對于原核生物表達具有一系列可以保證蛋白活性的翻譯后修飾，但是釀酒酵母相對于畢赤酵母表達依然存在一些缺陷。最明顯的缺陷便是目前的釀酒酵母多采用附加型轉化的方式。比如常見的PYES2載體搭配INVSC1的宿主以及PEGH載體搭配Y258宿主都是采用這樣的遺傳轉化方式。而目前主流的畢赤酵母遺傳轉化方式為整合型轉化方式。通常需要把環形的質粒進行線性化酶切之后整合到畢赤酵母的基因組上。整合型的遺傳轉化方式外源基因的復制擴增可以隨著酵母的基因組基因的復制擴增而擴增，且傳代比較穩定，在不含有外界篩選壓力的情況下外源基因不會被丟失。

本申請提供了一種整合型酵母重組表達系統及使用方法，目的在于改變目前酵母表達中普遍遇到的附加型整合方式帶來的遺傳傳代不穩定，以及導致高密度發酵的時候質粒丟失產生不表達的現象。本申請的酵母表達系統構建得到URA3基因改造的基因缺陷型貝酵母菌株作為遺傳轉換的篩選標記，同時也為PYIP5的轉化提供可以用于整合遺傳的整合位點。該表達系統適用于多種酵母。經過驗證該酵母整合方式傳代300代均能穩定遺傳，且高密度發酵中可以節省90％的培養基成本。

發明內容

本發明目的在于改變目前酵母表達中普遍遇到的附加型整合方式帶來的遺傳傳代不穩定，以及導致高密度發酵的時候質粒丟失產生不表達的現象，提供一種整合型酵母重組表達系統及使用方法。

首先，本申請提供了一種整合型酵母，該酵母為URA3基因缺陷型，并含表達URA3基因且整合到酵母基因組的載體。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全長或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通過同源置換實現。所述載體可以是整合型質粒載體。所述載體可以是表達URA3基因的載體。所述整合型質粒載體可以pYIP5。所述酵母可以是釀酒酵母或貝酵母。該酵母還含有能夠穩定遺傳的外源基因。進一步地，該基因可以是PGC3。

本申請還提供了一種整合型酵母表達系統，該表達系統包括整合型酵母，該酵母為URA3基因缺陷型，并含表達URA3基因且整合到酵母基因組的載體。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全長或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通過同源置換實現。所述載體可以是整合型質粒載體。所述載體可以是表達URA3基因的載體。所述整合型質粒載體可以pYIP5。所述酵母可以是釀酒酵母或貝酵母。該酵母還含有能夠穩定遺傳的外源基因。進一步地，該基因可以是PGC3。

本申請還提供了一種構建酵母及酵母表達系統的方法，其特征在于構建URA3基因缺陷型酵母，將含有URA3基因及外源基因的載體線性化后整合至酵母基因組。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全長或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通過同源置換實現。所述載體可以是整合型質粒載體。所述載體可以是表達URA3基因的載體。所述整合型質粒載體可以pYIP5。所述酵母可以是釀酒酵母或貝酵母。該酵母還含有能夠穩定遺傳的外源基因。進一步地，該基因可以是PGC3。