[發(fā)明專利]一種負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、應(yīng)用的敷料及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811048577.4
• 申請(qǐng)日: 2018-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN109112110A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉波;劉杰;呂其君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉波
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113;A61L26/00
• 代理公司: 深圳市朝聞專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44454
• 代理人: 譚育華

本發(fā)明提供一種負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、應(yīng)用的敷料及其制備方法，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體制備方法包括：制備間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，提取上清液中的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，電轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，使其負(fù)載目標(biāo)miRNA。由于使用電轉(zhuǎn)染的方式將目標(biāo)miRNA負(fù)載于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中，明顯提高了外泌體治療的針對(duì)性，加快皮膚傷口的修復(fù)；采用先提取間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體后電轉(zhuǎn)染的制備步驟，提高了轉(zhuǎn)染的效率，縮短整體制備時(shí)間，易控制miRNA用量，提升轉(zhuǎn)染質(zhì)量；敷料采用負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體結(jié)合水凝膠在傷口局部以涂層的方式給藥，提高了外泌體及miRNA的利用率，同時(shí)將外泌體與水凝膠分開保存，有利于含外泌體敷料的長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、應(yīng)用的敷料及其制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一組源于基質(zhì)的異質(zhì)細(xì)胞群，具有自我更新、多向分化潛能，其在組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)方面有較為顯著的能力和廣闊前景。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，易于獲得，可在脂肪、骨髓、牙髓、臍帶、臍帶血、經(jīng)血、尿液、角膜等組織中獲得。

外泌體(exosome)為微小囊泡，直徑約為30-140nm，是在生理或病理情況下由多種細(xì)胞內(nèi)膜以出芽方式形成的多泡體，參與細(xì)胞間的信息交流，并參與到多種生理病理過程中。來源于不同組織的外泌體本身攜帶有多種MicroRNA(miRNA)、mRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)分子等物質(zhì)，在組織修復(fù)過程中，外泌體所負(fù)載的生物大分子可以促進(jìn)控制炎癥、促進(jìn)參與修復(fù)的細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)血管化及再上皮化等。然而，由于其外泌體負(fù)載的非特異性，往往促進(jìn)修復(fù)的作用不甚顯著。

通過生物工程改造外泌體的負(fù)載，使之能根據(jù)傷口修復(fù)的狀態(tài)負(fù)載特異性的促修復(fù)因子，則可以明顯提高其促進(jìn)修復(fù)的作用。

但是在現(xiàn)有技術(shù)中，外泌體的miRNA負(fù)載效果并不理想，仍然存在效率低、過程難控制的缺陷。

同時(shí)，外泌體的給藥途徑中局部給藥不僅可以提高利用率，還可避免有創(chuàng)性給藥，提高患者依從性，故構(gòu)建含外泌體敷料十分有必要。然而既往的含外泌體敷料制備技術(shù)是將外泌體與原料混合后再交聯(lián)制備敷料。這種方法弊端其一會(huì)使有生物活性的外泌體破裂而導(dǎo)致作用大大下降；其二外泌體在敷料中無法遷移，其釋放率相當(dāng)有限，造成珍貴外泌體的大量浪費(fèi)；其三，外泌體與水凝膠的保存條件不同，這種混合敷料無法長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸，十分不利于臨床轉(zhuǎn)化與推廣。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體、應(yīng)用的敷料及其制備方法，該間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法具有強(qiáng)度高的特點(diǎn)，同時(shí)具有提高目標(biāo)miRNA的負(fù)載效率和質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)第一方面，一種實(shí)施例中提供一種負(fù)載目標(biāo)miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，包括以下步驟:

制備間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清液,提取上清液中的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，電轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，使其負(fù)載目標(biāo)miRNA。

進(jìn)一步地，具體步驟包括：

S11、制備間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清液：將2-5代的間充質(zhì)干細(xì)胞胰酶消化后接種，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，接種完成后放置于溫度為37℃、CO₂體積濃度比為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)融合度達(dá)到60-80％時(shí)，使用PBS洗滌，用不含酚紅、不含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集培養(yǎng)基上清液-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S12、提取間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體：取出S11中的培養(yǎng)基上清液，解凍離心后，經(jīng)過0.22um濾膜過濾，用100KDa超濾管濃縮至1/30體積，再將濃縮的培養(yǎng)基上清液超速離心后去上清，PBS重懸并再次超速離心，洗滌外泌體沉淀物，得到間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體；