[發明專利]一種負載目標miRNA的間充質干細胞外泌體、應用的敷料及其制備方法

在審

• 申請號: 201811048577.4
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN109112110A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 劉波;劉杰;呂其君
• 申請（專利權）人: 劉波
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;A61L26/00
• 代理公司: 深圳市朝聞專利代理事務所(普通合伙) 44454
• 代理人: 譚育華

1.一種負載目標miRNA的間充質干細胞外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

制備間充質干細胞培養基上清液，提取所述上清液中的間充質干細胞外泌體，電轉染所述間充質干細胞外泌體，使其負載目標miRNA。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括：

S11、制備間充質干細胞培養基上清液：將2-5代的間充質干細胞胰酶消化后接種，培養基為含10％胎牛血清DMEM培養基，接種完成后放置于溫度為37℃、CO₂體積濃度比為5％的培養箱中培養，當融合度達到60-80％時，使用PBS洗滌，用不含酚紅、不含血清的DMEM培養基繼續培養48小時，收集培養基上清液-80℃保存備用；

S12、提取間充質干細胞外泌體：取出所述S11中的培養基上清液，解凍離心后，經過0.22um濾膜過濾，用100KDa超濾管濃縮至1/30體積，再將濃縮的所述培養基上清液超速離心后去上清，PBS重懸并再次超速離心，洗滌外泌體沉淀物，得到間充質干細胞外泌體；

S13、電轉染目標miRNA：用電轉染緩沖液重懸所述間充質干細胞外泌體，并調整其濃度，得到預定濃度的外泌體懸液，同時用無核酶水將目標miRNA溶解配制成預定濃度的miRNA溶液，將所述外泌體懸液與miRNA溶液混合，用電轉染儀器進行轉染，電擊完成后將外泌體懸液置于37℃下恢復，并對其超速離心、去上清、PBS重懸，得到導入了目標miRNA的干細胞外泌體懸液，調整粒子數為1×10¹²/ml后保存于-80℃備用。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，其具體步驟包括：

S11、制備間充質干細胞培養基上清液：將2-5代的間充質干細胞胰酶消化后按照1:2比例進行接種，培養基為含10％胎牛血清DMEM培養基，接種完成后放置于溫度為37℃、CO₂體積濃度比為5％的培養箱中培養，當融合度達到70-80％時，使用PBS洗滌3次，用不含酚紅、不含血清的DMEM培養基繼續培養48小時，收集培養基上清液-80℃保存備用；

S12、提取間充質干細胞外泌體：取出所述S11中的培養基上清液，在4℃或37℃的條件下解凍，以2000rpm的轉速離心30min，經過0.22um濾膜過濾，用100KDa超濾管濃縮至1/30體積，再將濃縮的所述培養基上清液在4℃、100000-120000rpm的條件下超速離心70min后去上清，PBS重懸并再次在4℃、100000-120000rpm的條件下超速離心70min，洗滌外泌體沉淀物，得到間充質干細胞外泌體；

S13、電轉染目標miRNA：用1ml電轉染緩沖液重懸所述間充質干細胞外泌體，通過NTA檢測所述間充質干細胞外泌體的濃度并調整其濃度，得到預定濃度的外泌體懸液，同時用無核酶水將目標miRNA溶解配制成預定濃度的miRNA溶液，將所述外泌體懸液與miRNA溶液混合，用電轉染儀器進行轉染，電擊完成后將外泌體懸液置于37℃下恢復5min，并對其在4℃，100000-120000rpm的條件下超速離心70min，去上清后PBS重懸，得到導入了目標miRNA的干細胞外泌體懸液，調整粒子數為1×10¹²/ml后保存于-80℃備用。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述目標miRNA為miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一種；所述miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129的序列分別如SEQIDNO:1-12。

5.根據權利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述間充質干細胞包括脂肪干細胞、骨髓干細胞、臍帶干細胞、臍帶血干細胞、牙髓干細胞、經血干細胞、尿液來源干細胞中的至少一種。

6.一種由權利要求1-3中任一項所述的制備方法制備得到的負載目標miRNA的間充質干細胞外泌體。