[發明專利]基于LAMP檢測多肉植物莖腐病菌的引物組合及其應用

在審

• 申請號: 201811047812.6
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN108977508A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 姚錦愛;黃鵬;陳漢鑫;余德億
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供了基于LAMP檢測多肉植物莖腐病菌的引物組合及其應用。用于檢測多肉植物莖腐病菌的LAMP引物組合由1對外側引物F3/B3和1對內側引物FIP/BIP組成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQ ID NO.1?4所示。本發明的檢測體系在65℃等溫條件下，通過1 h溫育，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到多肉植物莖腐病菌，不需要復雜昂貴的儀器，能較好地滿足對多肉植物莖腐病菌的現場檢測，可廣泛應用于基層單位田間病害的早期診斷和病菌的監測、鑒定，為防治多肉植物莖腐病提供可靠的技術和理論依據。

技術領域

本發明屬于園藝作物病害檢測、鑒定及防治技術領域，具體涉及多肉植物莖腐病菌的環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）檢測的引物組合及其應用，可用于多肉植物莖腐病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于多肉植物莖腐病的早期診斷和監測鑒定。

背景技術

多肉植物是指植物營養器官肥大的高等植物，通常具根、莖、葉三種營養器官和花、果實、種子三種繁殖器官。在園藝上，又稱肉質植物或多肉花卉，但以多肉植物這個名稱最為常用。多肉植物作為盆栽在世界各地廣受歡迎，目前常見的種類大多屬于景天科和仙人掌科。

莖腐病的病原為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，是危害多肉植物的主要性真菌病害，屬半知菌亞門真菌，也是一類世界性分布的真菌，分布極廣，普遍存在于土壤及動植物有機體上，甚至存在于嚴寒的北極和干旱炎熱的沙漠，屬于兼寄生或腐生生物。它不僅可以在土壤中越冬和越夏，還會在不同的觀賞植物上表現為不同的專化型；其專一性地引起觀賞植物維管束病害，破壞植物的輸導組織，并在植物生長發育代謝過程中產生毒素來危害作物，造成植物萎蔫死亡，影響產量和品質，該病是目前觀賞花卉生產中防治比較困難的重要病害之一。多肉植物一遇此病會大量猝倒，萎縮死亡，植株莖部會開始出現褐色病斑，接著內部腐爛，直至全株猝倒死亡。由于多肉植物莖腐病是一種土傳病害，防治上主要以預防為主，防治是否及時，直接影響了對土傳病害的防治效果。因此生產上迫切需要建立一種快速、準確的檢測多肉植物莖腐病菌的方法，為病害的早期診斷與防治、監測、預測預報提供支持和服務，對發展多肉植物生產、增加花農收入、減少環境污染和維持農業可持續發展，都具有重大的生產意義。

當前，病原菌的檢測方法較多，傳統真菌菌種鑒定方法主要以形態學為依據，將菌種鑒定到綱、目、科、屬、種。真菌的形態特征復雜，且有些菌類形態特征和生理生化特征隨著環境的變化而不穩定，因此，在傳統的真菌分類中常引起分類系統的不一致。同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾，不能直觀的在病害潛伏期和初發期做出診斷，很難對病害發生進行及時的監測和有效控制。

隨著生物化學、遺傳學以及分子生物學的發展，為病原菌的分類鑒定提供了技術條件。如血清學免疫學技術、常規PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR等技術為病原菌的分類鑒定提供了靈敏度高、快速的檢測技術。但這些分子生物學技術在一定程度上也存在了一些不足之處，如血清免疫學檢測技術在血清的制備過程耗時耗力，常常受到抗血清質量的影響，且可能存在交叉反應，特異性較差，容易造成假陽性，PCR快速檢測技術主要包括常規PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實時熒光定量PCR等，PCR技術檢測時間較長，需要依賴貴重、精密的PCR儀、凝膠成像系統等貴重儀器設備及相應的高新技術人員，因而提高了檢測成本，并限制了其應用范圍，不利于基層生產上推廣應用，限制了這些先進方法的推廣應用。