[發明專利]基于LAMP檢測多肉植物莖腐病菌的引物組合及其應用

在審

• 申請號: 201811047812.6
• 申請日: 2018-09-10
• 公開（公告）號: CN108977508A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 姚錦愛;黃鵬;陳漢鑫;余德億
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.基于LAMP檢測多肉植物莖腐病菌的引物組合，其特征在于：所述引物組合由1對外側引物F3/B3和1對內側引物FIP/BIP組成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：

F3: 5'- CAGTATTCTGGCGGGCATG-3'，

B3: 5'- ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3'；

FIP:5'-TGGGGAACGCGAATTAACGCGGAGCGTCATTTCAACCCTCA-3'，

BIP:5'-GTCACGTCGAGCTTCCATAGCGAGAAGTTGGGGTTTAACGGC-3'。

2.如權利要求1所述的引物組合在多肉植物莖腐病菌LAMP檢測中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，其檢測方法包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA；

（2）LAMP反應體系的建立：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的外側引物F3/B3和內側引物FIP/BIP進行LAMP擴增，LAMP檢測反應體系為25 μL，反應體系中包含：20 mM Tris-HCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、8.0 mM MgSO₄、50 mM KCl、0.8 mM 甜菜堿、1.75mmol·L^-1 dNTPs、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 μmol·L^-1的FIP和BIP、0.2 μmol·L^-1的F3和B3，1μL模板DNA50-100 ng，無菌雙蒸水補充至25 μL，在PCR管蓋上加入2 μL的1000×SYBRGreenⅠ；

（3）LAMP反應條件：65 ℃溫育60 min，85℃滅活10min，冰上終止反應；

（4）反應結果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進行測定；采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應結束后，瞬時離心，將SYBR GreenⅠ離心到PCR管的底部，觀察顏色變化，顯色結果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，存在多肉植物莖腐病菌，橙色或橘黃色判斷為陰性，不存在多肉植物莖腐病菌；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現梯形條帶判斷為陽性，存在多肉植物莖腐病菌，沒有出現條帶則判斷為陰性，不存在多肉植物莖腐病菌。

4.如權利要求1所述的引物組合在多肉植物莖腐病菌的早期診斷、監測和鑒定上的應用。