[發明專利]用于檢測人類PIK3CA基因E545K突變的引物、檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811044875.6
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109306374A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 陳淵能;何浪平;陳韻姿
• 申請（專利權）人: 廣州健天基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發明提供了用于檢測人類PIK3CA基因E545K突變的引物、檢測方法及試劑盒。本發明提供的檢測引物能與PIK3CA基因E545K的特異序列結合，擴增突變序列。本發明提供的檢測方法采用檢測熒光信號基團能與擴增片段結合發出熒光信號，利用阻斷劑與突變位點對應的野生型序列特異性結合，抑制野生型非特異性擴增。本發明采用競爭性等位基因特異性PCR擴增技術，建立基于實時熒光PCR的試劑盒，可準確檢測PIK3CA基因E545K突變。本發明方法操作簡單，結果易讀；靈敏度高，能檢出含0.001％PIK3CA基因E545K突變的樣本,實現對PIK3CA基因E545K突變的超靈敏檢測。

本申請要求了2017年09月08日提交中國專利局的，申請號為201710805686.5，發明名稱為“用于超靈敏檢測人類PIK3CA基因E545K突變的引物、檢測方法及試劑盒”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測人類PIK3CA基因E545K突變的引物、檢測方法及試劑盒。

背景技術

點突變與許多腫瘤有著密切的關系，已有研究表明，某些基團位點的點突變會使腫瘤的發生率大幅提高。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是催化肌醇基團磷酸化的激酶，由催化亞基和調節亞基組成的異二聚體；根據其底物結構不同分I、II和III型。PI3K是EGFR下游信號分子，可被生長因子受體酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使絲/蘇氨酸激酶(AKT)磷酸化而上調該通路的活性并產生多種生物學效應，包括調節細胞增殖、存活和細胞周期調控等。

已發現在多種癌癥中(如乳腺癌、非小細胞肺癌等)存在PIK3CA基因突變，PIK3CA基因突變導致PI3K/Akt信號通路持續性活化。PI3K作為EGFR下游信號分子被激活，導致腫瘤細胞對EGFR-TKI等藥物的耐藥。所以，檢測PIK3CA基因突變可以預測腫瘤患者對 EGFR-TKI等藥物的耐藥性。

目前基因突變檢測可以從兩個層次入手：一是蛋白質層次的間接檢測，主要借助一些蛋白質分析技術，分析突變體產生的變異蛋白，以及由變異蛋白引起的其他改變；二是對遺傳物質(主要是脫氧核糖核酸DNA)的直接檢測，主要以聚合酶鏈式反應(Polymerasechain reaction， PCR)技術為代表，該技術的檢測準確度與組織標本的結果符合率較高；測序法能夠直接得出目的DNA片段的堿基序列，但相對于眾多的突變檢測方法顯得費時費力。

若能在癌癥早期檢測出癌基因，早發現早治療，另外，快速準確靈敏地檢測這些與藥物反應性有關的基因突變，可以大大提高癌癥患者的存活率。但由于癌癥早期癌變樣品特別是血液樣品中的癌基因含量很少，而以上方法的檢測靈敏度最多只能達到0.2％，遠遠還沒達到從大量正常DNA背景下檢測極其微量的異常DNA分子的要求，因此，快速準確靈敏地檢測這些PIK3CA基因突變，就成為人們亟待解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了用于檢測PIK3CA基因E545K突變的引物、檢測方法。本發明還提供了含有該引物和檢測方法的試劑盒，通過特異性擴增技術，在抑制正常背景的情況下，把微量的異常DNA分子指數擴增，能從十萬個正常DNA分子的背景之下，檢測到一個異常 DNA分子，其靈敏度達到0.001％，實現了PIK3CA基因突變的超靈敏檢測。

本發明第一方面提供用于檢測人類PIK3CA基因E545K突變的檢測方法，包括如下步驟：將用于檢測人類PIK3CA基因E545K突變的引物、阻斷劑、檢測熒光信號基團、待測基因樣品混合，進行實時熒光定量PCR，獲得檢測結果；

其中，所述引物序列包括突變上游引物和突變下游引物，其中，所述突變上游引物，其長度為15-40個堿基，與待測PIK3CA基因E545K突變型的一條鏈互補；所述突變下游引物長度為15-40個堿基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的堿基為突變位點，與待測PIK3CA基因E545K突變型的另一條鏈互補；