[發(fā)明專利]一種基于sRNA介導的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811044297.6
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109097386B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設計）人: 康振;陳堅;堵國成;韋朝寶;金學榮
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種基于sRNA介導的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在基因組上對基因的表達進行精確的調(diào)控，例如改變細胞形態(tài)達到所希望的生物形態(tài)，例如對代謝途徑進行精確的動態(tài)調(diào)控提高生物合成目標產(chǎn)物產(chǎn)量，達到良好效果。與其他調(diào)控方法相比，具有較低的誘導濃度和很高的穩(wěn)定性，具有精確的動態(tài)調(diào)控的優(yōu)勢，操作簡便，應用廣泛。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于sRNA介導的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的快速的發(fā)展，人們越來越希望在基因組上對基因的表達進行精確的調(diào)控。sRNA在細菌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起非常關(guān)鍵的作用，在大量的物種中發(fā)現(xiàn)它們以RNA/RNA堿基配對或與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式來抑制或激活靶基因表達，毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)也是以這樣的機理發(fā)揮作用的。毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)是成對的相鄰基因，毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)表達的穩(wěn)定的毒性肽被毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)表達的不穩(wěn)定的抗毒素中和。毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)包括三種類型，在I型TA系統(tǒng)中，抗毒素是小的反義RNA，其會與轉(zhuǎn)錄成編碼mRNA的毒素通過RNA/RNA結(jié)合發(fā)揮抑制作用；在II型系統(tǒng)中，發(fā)生相互作用的毒素和抗毒素都是蛋白質(zhì)；III型系統(tǒng)(ToxIN)中，肽毒素與作為抗毒素的短[36核苷酸(nt)]RNA假結(jié)合相互作用。

枯草芽孢桿菌的內(nèi)源性毒素-抗毒素系統(tǒng)有txpA/RatA、bsrG-sr4、bsrE-sr5、yonT/as-yonT、bsrH/as-bsrH，其中，bsrE-sr5是位于枯草芽孢桿菌染色體的原噬菌體樣區(qū)域P6上的I型毒素/抗毒素系統(tǒng)。編碼30個氨基酸疏水性毒素的bsrE基因和抗毒素基因sr5在bsrE-sr5的3'末端重疊112bp。bsrE基因過表達會導致細胞裂解，RNase J1是bsrE與sr5兩種RNA降解的主要參與者，RNaseⅢ切割bsrE/SR5雙鏈體。txpA/RatA、bsrG-sr4、yonT/as-yonT、bsrH/as-bsrH也有相似的功能和作用機理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌內(nèi)源性毒素-抗毒素系統(tǒng)bsrE-sr5，構(gòu)建了基于sRNA介導的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方法，可以實現(xiàn)對基因的表達進行精確的調(diào)控。

所述方法包括以下步驟：

先將枯草芽孢桿菌基因組上內(nèi)源性毒素-抗毒素系統(tǒng)bsrE-sr5的基因序列從基因組敲除，再(1)在枯草芽孢桿菌基因組上將毒素基因opr⁵整合至目標基因的終止密碼子TAA之后，或(2)將由組成型啟動子調(diào)控的毒素基因opr⁵連接至目標基因(尤其是外源基因)終止密碼子TAA之后以構(gòu)建表達框，將表達框整合到枯草芽孢桿菌基因組上；然后，將由木糖誘導型啟動子調(diào)節(jié)的抗毒素基因sr5的表達框組裝在內(nèi)源表達載體中，將內(nèi)源表達載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，通過木糖誘導控制抗毒素基因sr5的表達，達到對目標基因進行精確的動態(tài)調(diào)控的目的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168。

在本發(fā)明的一種實施方式中，可以抑制ftsZ基因的表達，使枯草芽孢桿菌的菌體變長。

在本發(fā)明的一種實施方式中，可以對枯草芽孢桿菌異源表達透明質(zhì)酸、軟骨素、肝素等產(chǎn)物途徑進行精確的動態(tài)調(diào)控，以提高生物合成目標產(chǎn)物產(chǎn)量。

有益效果：本發(fā)明在基因組上對基因的表達進行精確的調(diào)控，例如改變細胞形態(tài)達到所希望的生物形態(tài)，例如對代謝途徑進行精確的動態(tài)調(diào)控提高生物合成目標產(chǎn)物產(chǎn)量，達到良好效果。與其他調(diào)控方法相比，本發(fā)明具有非常大的應用優(yōu)勢。首先，本發(fā)明的調(diào)控方法具有較低的誘導濃度和很高的穩(wěn)定性(在100代中沒有觀察到質(zhì)粒的丟失)。其次，本發(fā)明的調(diào)控方法具有精確的動態(tài)調(diào)控的優(yōu)勢，操作簡便，應用廣泛。

附圖說明

圖1為基于sRNA介導的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建及作用機理示意圖；