[發明專利]用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811043341.1
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109295176A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳淵能;何浪平;陳韻姿
• 申請（專利權）人: 廣州健天基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發明提供了用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、檢測方法及試劑盒。本發明提供的檢測引物能與BRAF基因的特異序列結合，擴增突變序列。本發明提供的檢測方法采用檢測熒光信號基團與擴增片段結合發出熒光信號，利用阻斷劑與突變位點對應的野生型序列特異結合，抑制野生型非特異性擴增。本發明采用競爭性等位基因特異性PCR擴增技術，建立基于實時熒光PCR的試劑盒，可準確檢測BRAF基因V600E突變。本發明方法操作簡單，結果易讀，靈敏度高，能檢出含0.001％BRAF基因V600E突變的樣本，實現對BRAF基因V600E突變的超靈敏檢測。

本申請要求了2017年09月08日提交中國專利局的，申請號為201710806477.2，發明名稱為“用于超靈敏檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、檢測方法及試劑盒”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、檢測方法及試劑盒。

背景技術

BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤文氏肉瘤中發現并克隆確認的，是一個能轉染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列，因其與CRAF和ARAF具有相當高的同源性，故稱其為BRAF。BRAF癌基因編碼的BRAF蛋白是有絲分裂原活化的蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(MAPK/ERK)途徑蛋白，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，在凋亡和增殖過程中起著重要作用，位于MAPK通路入口處，它將細胞表面的受體和RAS蛋白通過 MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，調節細胞的生長、發育。近來研究發現，人類的許多惡性腫瘤中都有BRAF基因突變，BRAF作為分子標記在多種腫瘤的發生發展中充當著重要角色。調查顯示，大約有65％的結直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤與該家族中的BRAF突變體有關。BRAF突變后持續性激活MAPK通路，使有絲分裂能力增強，導致細胞異常增殖和分化。

約66％惡性黑色素瘤和15％的結腸癌中BRAF基因存在體細胞錯義突變。大約80-90％的BRAF基因突變發生在exon15的1799核苷酸上，T突變為A，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。目前認為，V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使得BRAF蛋白異常激活。

當人們發現了這一點后，便開始研發生產出一些能夠抑制BRAF突變的藥物，并且在臨床上應用上取得了重要的成果，比如威羅菲尼片(vemurafenib)，能對那些腫瘤表達原癌基因BRAF的病人起到非常好的效果。另一方面，在臨床使用抗BRAF藥物之前，進行腫瘤組織中BRAF基因型的鑒定是一件非常重要的事情。對BRAF基因突變進行快速、可靠且經濟的檢測，可指導腫瘤相關靶向藥物的選擇、甲狀腺癌等分子診斷、為輔助臨床醫生進行診斷和治療所需。

目前BRAF基因突變檢測的方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶解曲線檢測法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，高效液相色譜法，熒光定量PCR法等。其中最常見方法還是測序法，該法費用較低，但操作耗時長，并且它有兩個明顯的缺點：一是靈敏度低，一般需要突變基因豐度達到10％以上才能準確檢測。二是由于后續需要對PCR 產物進行處理，容易出現污染導致結果不準確。

若能在癌癥早期檢測出癌基因，早發現早治療，另外，快速準確靈敏地檢測這些與藥物反應性有關的基因突變，可以大大提高癌癥患者的存活率。但由于癌癥早期癌變樣品特別是血液樣品中的癌基因含量很少，而以上方法的檢測靈敏度最多只能達到0.2％，遠遠還沒達到從大量正常DNA背景下檢測極其微量的異常DNA分子的要求。因此，如何快速準確的檢測 BRAF基因突變，就成為人們亟待解決的問題。

發明內容