[發明專利]用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811043341.1
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109295176A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳淵能;何浪平;陳韻姿
• 申請（專利權）人: 廣州健天基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

1.用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：將用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、阻斷劑、檢測熒光信號基團、待測基因樣品混合，進行實時熒光定量PCR，獲得檢測結果；

其中，引物包括突變上游引物和突變下游引物，所述突變上游引物，其長度為15-40個堿基，靠近3’末端的某一位置的堿基為突變位點，與待測BRAF基因V600E突變的一條鏈互補，所述突變下游引物，長度為15-40個堿基，與待測BRAF基因V600E突變的另一條鏈互補；

所述阻斷劑能與BRAF基因V600E突變位點野生型序列特異結合，抑制野生型非特異擴增；

所述檢測熒光信號基團能與PCR擴增片段結合并發出熒光信號。

2.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，所述突變上游引物，其長度為25個堿基，靠近3’末端的第3位的堿基為突變位點，與待測BRAF基因V600E突變的一條鏈互補。

3.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，所述突變下游引物，其長度為26個堿基，與待測BRAF基因V600E突變的另一條鏈互補。

4.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，所述突變上游引物的序列包括：

GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGA(SEQ ID NO.1)

所述突變下游引物的序列包括：

AGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA(SEQ ID NO.2)。

5.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，所述阻斷劑能與BRAF野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修飾有化學基團；

其中，所述阻斷劑中匹配BRAF野生型基因的核酸序列包括：

TTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTC(SEQ ID NO.3)；

所述化學修飾基團包括：胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一種或多種。

6.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法，其特征在于，所述檢測熒光信號基團包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO 9、SYBR MIX中的一種或多種。

7.用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物，其特征在于，其中，引物包括突變上游引物和突變下游引物，所述突變上游引物，其長度為15-40個堿基，靠近3’末端的某一位置的堿基為突變位點，與待測BRAF基因V600E突變的一條鏈互補，所述突變下游引物，長度為15-40個堿基，與待測BRAF基因V600E突變的另一條鏈互補。

8.用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的阻斷劑，其特征在于，所述阻斷劑能與BRAF基因V600E突變位點野生型序列特異結合，抑制野生型非特異擴增。

9.用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的試劑盒，其特征在于，包括如權利要求7所述用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物、如權利要求8所述用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的阻斷劑，還包括檢測熒光信號基團。

10.如權利要求1所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測方法、權利要求7所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的引物和/或權利要求8所述的用于檢測人類結直腸癌BRAF基因V600E突變的試劑盒在檢測人胃腸道間質瘤BRAF基因突變中的應用，所述應用在突變型基因濃度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的樣品檢測人類結直腸癌BRAF基因突變中的應用。