[發明專利]干血片中胍基乙酸和肌酸濃度的定量檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811042701.6
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN108828109A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 劉輝宇;張瑞雪;鄒敏旭
• 申請（專利權）人: 質譜生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓;尹妍

本發明公開了一種干血片中胍基乙酸和肌酸濃度的定量檢測方法及試劑盒。將內標品液用干血斑萃取液稀釋成工作液；之后將工作液加入樣本中孵育；最后采用串聯質譜法檢測樣本中胍基乙酸和肌酸濃度。本發明的方法可以使準確地檢測各類型濾紙干血片中的胍基乙酸（GAA）和肌酸（CRE）濃度。

技術領域

本發明涉及生化檢測設備技術領域，尤其涉及一種干血片中胍基乙酸和肌酸濃度的定量檢測方法及試劑盒。

背景技術

肌酸缺乏綜合征(creatine deficiency syndromes，CDS)是一組影響肌酸合成及轉運的先天性遺傳代謝性疾病，其生化特點為腦肌酸缺乏。臨床表現為智力缺損、語言發育遲緩、孤獨癥、癲癇發作、肌張力減退、以錐體外系損害為主的運動障礙和行為問題等。CDS可能是眾多原因不明精神發育遲滯兒童的致病原因，早期診斷并給予肌酸治療，可改善預后。

肌酸缺乏綜合征根據基因缺陷分為三種類型：精氨酸：甘氨酸脒基轉移酶(arginine：glycineamidinotransferase，AGAT)缺陷、胍基乙酸甲基轉移酶(Guanidinoacetate methyltransferase，GAMT)缺陷和肌酸轉運蛋白SLC6A8基因缺陷。

GAMT缺陷患者在尿、血漿、腦脊液、濾紙干血片樣本中出現胍基乙酸增高，肌酸和肌酐減低，肌酸/肌酐比值不變，但胍基乙酸/肌酸比值明顯增高。應用濾紙干血片樣本測定胍基乙酸和肌酸及其比值可用于GAMT缺陷的輔助診斷

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于串聯質譜的干血片中胍基乙酸(GAA)和肌酸(CRE)濃度的定量檢測技術及試劑盒。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種干血片中胍基乙酸和肌酸濃度的定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)制備內標品液：在內標品中加入純水，混勻直至完全溶解，真空干燥制成內標品液；

(2)制備工作液：采用萃取液萃取干血斑獲得干血斑萃取液，之后將步驟(1)制備的內標品液用干血斑萃取液稀釋成工作液；

(3)利用打孔器將空白濾紙片、質控品濾紙片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入步驟(2)制備的工作液；將96孔板密封放入孵育振蕩器內孵育；

(4)振蕩結束后，取孵育溶液，采用串聯質譜法檢測樣本中胍基乙酸和肌酸濃度。

本發明的方法，所述步驟(1)中，內標品成分為d3-肌酸和d2-胍基乙酸。

所述步驟(2)中，干血斑萃取液可以在非衍生化的情況下使用，或經衍生化處理，在干血斑萃取液中加入衍生化試劑3N鹽酸正丁醇，37℃下衍生化30分鐘，獲得衍生化干血斑萃取液。用干血斑萃取液/衍生化干血斑萃取液按體積110倍稀釋成工作液；稀釋后內標品濃度為1μmol/L。所述的萃取液為體積含量50–90％甲醇水溶液。

所述步驟(3)中，質控品包括低水平質控及高水平質控品，低水平質控品為3μmol/L胍基乙酸、50μmol/L肌酸；高水平質控品為8μmol/L胍基乙酸、300μmol/L肌酸。

利用打孔器將空白濾紙片、質控品濾紙片打孔，放入V截底型96孔板中，之后在各孔中加入工作液，將密封的V截底型96孔板置于孵育振蕩器內，在溫度為45±5℃，振蕩頻率為650–750轉/分的條件下，振蕩孵育45分鐘。

所述步驟(4)中，通過多反應監控MRM模式檢測，質譜條件見下表1：

表1胍基乙酸和肌酸測定的質譜條件

本發明還提供一種干血片中胍基乙酸和肌酸濃度的定量檢測試劑盒，包括：