[發明專利]用于測定末端轉移酶活性的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201811041659.6
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109055505B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 蔡統聰
• 申請（專利權）人: 廣東菲鵬生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/48
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 逯恒

本發明涉及一種用于測定末端轉移酶(TdT)活性的方法及試劑盒。所述方法包括：使用TdT在第一單鏈線性DNA的3’末端加上PolydN；將第二單鏈線性DNA作為第二單鏈模板，所述第二單鏈線性DNA的3’末端具有PolydN'，所述第二單鏈模板與所述第一單鏈模板僅通過N?N'部分進行互補配對；補齊互補DNA后進行擴增并定量檢測擴增產物，并根據所述擴增產物含量與所述TdT酶活的對應關系確定所述TdT活性；擴增時所用上下游引物分別與所述第一單鏈模板及所述第二單鏈模板結合，且結合部分不包括N?N'互補區，或同時包括N?N'互補區與非N?N'互補區。該方法操作步驟簡單快速，試劑成本低，靈敏度高。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體而言，涉及一種用于測定末端轉移酶活性的方法及試劑盒。

背景技術

末端轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)，又稱末端脫氧核苷酸轉移酶。一般自牛胸腺中分離，是一種無需模板的DNA末端轉移酶，催化脫氧核苷酸結合到DNA分子的3'羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物。

末端轉移酶是基因工程技術中一種重要的工具酶，末端轉移酶催化加上核苷酸至DNA分子的3'末端。不像大多數的DNA聚合酶，它的催化作用不需要模板。這種酶的優選底物是3'突出端，但它也可以添加核苷酸至鈍末端(blunt end)或凹陷的3'末端(recessed 3'end)。末端轉移酶在分子生物學中有很多應用。它可以被用來在cDNA末端快速擴增技術(RACE)中來添加核苷酸，也可以用于添加標記放射性同位素的核苷酸，例如在TUNEL染色中將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標記到DNA的3'末端，從而進行凋亡細胞的檢測；以及介導PCR、轉錄組文庫構建等等。

盡管末端轉移酶具有多種生物學功能，但目前已報道的對其檢測的方法很少。經典的末端轉移酶活性測定方法是放射性底物摻入法，該方法靈敏度雖然高，但受標記物質量所限，操作過程中易產生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于建立一種非放射性、簡便、快速的末端轉移酶活性測定方法。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種用于測定末端轉移酶活性的方法，包括：

a)使用末端轉移酶在第一單鏈線性DNA的3’末端加上多個相同的脫氧核苷酸N得到第一單鏈模板；

b)將第二單鏈線性DNA作為第二單鏈模板，所述第二單鏈線性DNA的3’末端具有多個脫氧核苷酸N'，所述第二單鏈模板與所述第一單鏈模板僅通過N-N'部分進行互補配對；

c)通過DNA聚合酶補齊所述第一單鏈模板與所述第二單鏈模板未互補部分得到雙鏈DNA；

d)對所述雙鏈DNA進行擴增并定量檢測擴增產物，并根據所述擴增產物含量與所述末端轉移酶酶活的對應關系確定所述末端轉移酶活性；

在進行擴增時，所用上下游引物分別與所述第一單鏈模板及所述第二單鏈模板結合，且結合部分不包括N-N'互補區，或同時包括N-N'互補區與非N-N'互補區。

本發明還涉及用于實施上述方法的試劑盒。

本發明還涉及組合物，其包含如上所述試劑盒中的成分，以及末端轉移酶。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)無放射性污染，對環境的要求低；

(2)操作步驟簡單快速，試劑成本低，靈敏度高。

附圖說明