[發(fā)明專利]用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811041659.6
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109055505B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設計）人: 蔡統(tǒng)聰
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東菲鵬生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/48
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 逯恒

1.用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，包括：

a）使用末端轉(zhuǎn)移酶在第一單鏈線性DNA的3’末端加上多個相同的脫氧核苷酸N得到第一單鏈模板；

b）將第二單鏈線性DNA作為第二單鏈模板，所述第二單鏈線性DNA的3’末端具有多個脫氧核苷酸N'，所述第二單鏈模板與所述第一單鏈模板僅通過N-N'部分進行互補配對；

c）通過DNA聚合酶補齊所述第一單鏈模板與所述第二單鏈模板未互補部分得到雙鏈DNA；

d）對所述雙鏈DNA進行擴增并定量檢測擴增產(chǎn)物，并根據(jù)所述擴增產(chǎn)物含量與所述末端轉(zhuǎn)移酶酶活的對應關(guān)系確定所述末端轉(zhuǎn)移酶活性；

在進行擴增時，所用上下游引物分別與所述第一單鏈模板及所述第二單鏈模板結(jié)合，且結(jié)合部分不包括N-N'互補區(qū)，或同時包括N-N'互補區(qū)與非N-N'互補區(qū)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述定量檢測的方法包括實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR、熒光染料法、共振光散射法或生物質(zhì)譜法。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，當所述定量檢測的方法為實時熒光定量PCR或數(shù)字PCR時，還使用探針進行定量；

所述探針帶有可檢測的標記。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述探針均為自身淬滅探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述自身淬滅探針的5′端標記熒光發(fā)射基團，3′端標記淬滅基團。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述熒光發(fā)射基團選自FAM、HEX、TAMRA、VIC和JOE中的任一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述猝滅基團選自TAMRA、BHQ、ECLIPSE和MGB中的任一種。

8.根據(jù)權(quán)利2所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，當所述定量檢測的方法為實時熒光定量PCR時，使用雙鏈特異性熒光染料定量。

9.根據(jù)權(quán)利8所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述雙鏈特異性熒光染料定量選自溴化乙錠、SYBR Green、PicoGreen、RiboGreen中的任一種。

10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶選自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一種。

11.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項所述的用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，確定所述擴增產(chǎn)物含量與所述末端轉(zhuǎn)移酶酶活的對應關(guān)系的方法包括：

將所述末端轉(zhuǎn)移酶梯度稀釋后使用步驟a）-d）對稀釋后的各梯度末端轉(zhuǎn)移酶進行分析，并建立末端轉(zhuǎn)移酶濃度-擴增產(chǎn)物含量的標準曲線。

12.用于測定末端轉(zhuǎn)移酶活性的試劑盒，其特征在于，其包含權(quán)利要求1中所提及的所述第一單鏈線性DNA、所述第二單鏈線性DNA、所述上下游引物作為常規(guī)組份，所述第一單鏈線性DNA和所述上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1、3、4所示；

所述第二單鏈線性DNA的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2和其3'端的多個脫氧核苷酸N'組成。