[發(fā)明專利]玉米籽粒中葉酸的提取和定量方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811041330.X
• 申請(qǐng)日: 2018-09-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109060996B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓莉妲;萬(wàn)幸;張春義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

本發(fā)明涉及植物葉酸提取，具體涉及一種玉米籽粒中葉酸的提取和定量方法。包括如下步驟：取玉米籽粒凍干粉，加入新制的提取液，超聲渦旋后，置于100℃溫度下震蕩10min，冰上迅速冷卻；加入α?淀粉酶，37℃下恒溫震蕩酶解；加入蛋白酶，37℃下恒溫震蕩酶解；離心，取上清液，即得；所述提取液的配方為：每100ml提取液中含有NaH₂PO₄ 249?349mg，Na₂HPO₄·2H₂O 659?759mg，L?抗壞血酸1?1.2g，2?巰基乙醇0.4?1.0ml，pH 6.8?7.0。本發(fā)明同時(shí)準(zhǔn)確定量了玉米籽粒中12種不同尾數(shù)、不同氧化態(tài)的葉酸，為葉酸代謝物的動(dòng)態(tài)分析提供了技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物葉酸提取，具體涉及一種玉米籽粒中葉酸的提取和定量方法。

背景技術(shù)

葉酸是一類水溶性維生素(VB9)，包含葉酸、四氫葉酸及其相應(yīng)的衍生物。作為一碳代謝的核心輔酶因子，葉酸在一碳循環(huán)以及DNA、氨基酸、蛋白等生命物質(zhì)的合成中發(fā)揮著重要的作用。在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同尾數(shù)、不同氧化形式的葉酸具有不同的生物活性，對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。作物是人類和動(dòng)物獲取葉酸的主要來(lái)源，然而，作物中的葉酸含量較低，尤其是在谷物中的含量更低。因此，通過(guò)基因工程和育種技術(shù)來(lái)提高植物體內(nèi)的葉酸水平成為了研究熱點(diǎn)，如何獲得作物中各種葉酸衍生物含量的可靠數(shù)據(jù)成為這一研究領(lǐng)域的關(guān)鍵。然而，由于天然樣品中的葉酸含量低并且存在多種不穩(wěn)定的衍生物，致使作物中各種葉酸的準(zhǔn)確定量面臨很大的挑戰(zhàn)。

此前已報(bào)道過(guò)生菜、花椰菜、細(xì)菌中的5-甲基四氫葉酸(5-M-THF)及其多谷氨酸衍生物的定量。但針對(duì)作物中天然的多谷氨酸5-甲酰四氫葉酸的定量少有報(bào)道。Campos等^[1]通過(guò)比較嬰幼兒配方奶粉在雙酶處理和三酶處理下的單谷氨酸5-甲酰四氫葉酸含量，利用差值表征其多谷氨酸鹽的含量，但缺乏對(duì)不同尾數(shù)多谷氨酸5-甲酰四氫葉酸的具體定量。Haandel等^[2]通過(guò)比較多谷氨酸蝶酰和4-氨基-10-甲基蝶酰六谷氨酸在LC-MS/MS中的響應(yīng)因子，推測(cè)相應(yīng)的多谷氨酸5-甲酰四氫葉酸的響應(yīng)因子并進(jìn)行定量，這一方法缺乏足夠的準(zhǔn)確性。

在各種生物體中，葉酸的代謝過(guò)程十分復(fù)雜，各種葉酸衍生物的含量和穩(wěn)定性各不相同，準(zhǔn)確檢測(cè)葉酸及其衍生物的含量十分困難。與細(xì)菌基質(zhì)相比，植物基質(zhì)的組成更為復(fù)雜。不同的植物基質(zhì)中，葉酸衍生物的組成和含量均不相同。在提取過(guò)程中，葉酸容易被植物組織中的淀粉包裹，因此，高淀粉作物(例如玉米、土豆、蓮藕)中的葉酸比低淀粉蔬菜(例如菠菜、生菜)中的葉酸更難以提取。

玉米是我國(guó)重要的糧食作物，研究玉米籽粒中的葉酸代謝，對(duì)于以營(yíng)養(yǎng)為導(dǎo)向的生物育種具有重要意義。然而，要準(zhǔn)確定量玉米籽粒中的葉酸及其衍生物，提取方法是關(guān)鍵，因?yàn)槿~酸提取的質(zhì)量直接影響到總?cè)~酸及各種葉酸衍生物的測(cè)定結(jié)果。迄今，對(duì)多谷氨酸5-甲酰-四氫葉酸(5-F-THF)的定量少有報(bào)道，因其面臨如下多種挑戰(zhàn)：(1)含量低于多谷氨酸5-M-THF，更低的含量帶來(lái)更大的提取和檢測(cè)難度；(2)葉酸的多谷氨酸形式在高溫下不穩(wěn)定，極易分解；(3)多谷氨酸葉酸易被內(nèi)源性的γ-谷氨酸水解酶水解。此外，檢測(cè)技術(shù)對(duì)葉酸的定量同樣重要。微生物檢測(cè)法是葉酸檢測(cè)中使用最多的方法，并收入了美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)^[3]和美國(guó)谷物化學(xué)師學(xué)會(huì)^[4]制定的推薦標(biāo)準(zhǔn)。然而，微生物方法具有分辨率低、線性范圍窄的缺點(diǎn)，并且不能區(qū)分不同形式的葉酸。

為了準(zhǔn)確檢測(cè)玉米籽粒中葉酸及其衍生物的含量，需要有針對(duì)性地建立一種穩(wěn)定可靠的葉酸檢測(cè)體系。

發(fā)明內(nèi)容

為滿足上述領(lǐng)域存在的需求，本發(fā)明提供一種能夠同時(shí)準(zhǔn)確定量玉米籽粒中12種不同尾數(shù)、不同氧化態(tài)葉酸的方法。

本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

從玉米籽粒中提取葉酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：