[發明專利]玉米籽粒中葉酸的提取和定量方法

有效

• 申請號: 201811041330.X
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN109060996B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 韓莉妲;萬幸;張春義
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

1.玉米籽粒中葉酸的定量方法，其特征在于，包括如下步驟：

標準曲線繪制：用提取液將待測葉酸的標準品溶液稀釋為梯度濃度，向每個濃度的標準品溶液中加入內標，然后分別進行HPLC–MS/MS檢測，建立標準品和內標的相對響應值與標準品和內標的相對濃度之間的標準曲線方程；所述待測葉酸為5-M-THFGlu₁、THF、5,10-CH=THF、10-F-FA、5-M-THFGlu₂、5-M-THFGlu₃、5-M-THFGlu₄、5-F-THFGlu₁、5-F-THFGlu₂、5-F-THFGlu₃、5-F-THFGlu₄、FA；

葉酸提取：包括如下步驟：

（1）取玉米籽粒凍干粉，加入新制的提取液，超聲渦旋后，置于100℃溫度下震蕩10min，冰上迅速冷卻；

（2）加入α-淀粉酶，37℃下恒溫震蕩酶解30 min；

（3）加入蛋白酶，37℃下恒溫震蕩酶解60 min；

（4）離心，取上清液，即得；

所述提取液的配方為：每100 ml提取液中含有NaH₂PO₄ 249-349 mg，Na₂HPO₄·2H₂O659-759 mg，L-抗壞血酸1-1.2 g，2-巰基乙醇0.4-1.0 ml，pH 6.8-7.0；

每毫克玉米籽粒凍干粉使用10-15 μL的提取液，0.48-0.72個酶活力單位的α-淀粉酶，0.0021-0.0028個酶活力單位的蛋白酶；提取時在提取液中加入內標；

葉酸定量：對提取物進行HPLC–MS/MS檢測，得到待測葉酸和內標的相對響應值；將待測葉酸和內標的相對響應值以及內標的濃度代入所述標準曲線方程中，計算得到待測葉酸的濃度；其中HPLC采用C18色譜柱，流動相A為0.1%（v/v）甲酸水溶液，流動相B為0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流動相梯度變化如下：

時間/分鐘	流動相B（%）
0	5
2	9
9	9.6
9.2	20
13.2	20
14	5

。

2.根據權利要求1所述的定量方法，其特征在于，每毫克玉米籽粒凍干粉加入13μL的提取液，0.48個酶活力單位的α-淀粉酶，0.0021個酶活力單位的蛋白酶。