[發明專利]一種提高單核細胞向多潛能細胞轉化的培養方法

在審

• 申請號: 201811040147.8
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN109097324A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 馬亞東;黃宗堂;曹娜
• 申請（專利權）人: 豐澤康生物醫藥（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及細胞的誘導分化方法，特別涉及一種提高單核細胞向多潛能細胞轉化的培養方法，將單核細胞培養在培養液中，待細胞達80％?90％融合后，消化處理，沉淀物再加入培養液傳代培養；再依次第一誘導培養液、第二誘導培養液誘導培養，換成培養液培養。本發明可以提高單核細胞向多潛能胚胎干細胞株分化，該成熟的細胞表現為多種標志蛋白的表達，使單核細胞能很好地運用到后續的實驗中，為臨床上更合理的將單核細胞用于治療提供了實驗數據和理論依據。

技術領域

本發明涉及細胞的誘導分化方法，特別涉及一種提高單核細胞向多潛能細胞轉化的培養方法。

背景技術

目前已經研究發現，在包括血管內皮生長因子在內的多種因子誘導下，單核細胞能夠轉化成血管內皮細胞，比如采用Ficoll密度梯度離心法分離成人新鮮外周血單核細胞，用細胞培養基培養，然后分別用纖維連接蛋白、腫瘤壞死因子α誘導24h。用RT-PCR和免疫細胞化學方法檢測單核細胞對淋巴管內皮特異性標志物LYVE-1、Podoplanin、Prox1、血管內皮生長因子受體3以及內皮細胞抗原vWF、內皮型一氧化氮合酶和血管內皮生長因子受體2的基因和蛋白表達。但是目前的單核細胞向多潛能細胞轉化率較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高單核細胞向多潛能細胞轉化的培養方法，通過該方法，將單核細胞誘導分化為成熟多潛能細胞。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種提高單核細胞向多潛能細胞轉化的培養方法，包括以下步驟：

(1)將單核細胞培養在培養液中，放入培養箱中，待細胞達80％-90％融合后，洗棄未貼壁的細胞；加入質量濃度0-25％胰蛋白酶進行消化處理直到細胞收縮呈圓形，加入培養液終止消化反應，采用離心分離3-5分鐘，然后沉淀棄去上清液，沉淀物再加入培養液，吸管輕輕吹打細胞制成懸液；按1∶4比例傳代培養到培養板上，置于培養箱中培養，每2-4天更換一次培養液；

所述的培養箱的條件均為37℃、體積分數5％CO₂。所述的培養液為KSFM培養液，并且加入體積百分比為10％的胎牛血清。

(2)待步驟(1)中的培養板上的細胞長滿后置于第一誘導培養液中進行誘導培養，兩天將第一誘導培養液更換成第二誘導培養液，在誘導培養兩天，然后將第二誘導培養液更換成培養液，將誘導好的細胞接種轉移至含有培養液的6孔板中培養，初次傳代時間為6-8天，細胞生長至90％融合，按照1∶4的比例轉移轉移至9cm平皿中進行傳代培養，3-4天傳代一次，連續傳代5-7代后，每2-4天更換一次培養液，獲得狀態良好的細胞，即為多潛能干細胞。

所述的培養液為KSFM培養液，并且加入體積百分比為10％的胎牛血清。

其中，所述的第一誘導培養液，以含有體積百分比為10％胎牛血清的KSFM培養液為基礎培養液，還包括有0.2-0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、3-5mmol/L地塞米松、120-350nmol/L胰島素、0.5-1.2nmol/L三碘甲狀腺原氨酸、0.1-0.25mmol/L吲哚美辛，1-2μmol/L羅格列酮；還含有50-100U/ml青霉素和50-100μg/ml鏈霉素。

所述的第二誘導培養液，以含有體積百分比為5％胎牛血清的KSFM培養液為基礎培養液，還包括6-10μg/ml胰島素，1-2nmol/L三碘甲狀腺氨酸，1-2μmol/L羅格列酮；

更優選地，還含有2-5μmol/L S-腺苷高半胱氨酸水解酶，10-30μg/ml維生素C，這是本發明的發明人發現會有在培養過程中雜菌產生的問題，在抑制雜菌生長的問題上發明人經過了多次試驗，后來發現使用具有廣譜抗病毒活性的腺苷衍生物的作用靶，尤其是抗出血熱病毒抑制劑的目的靶的S-腺苷高半胱氨酸水解酶具有最好的效果，同時，進一步添加維生素C可以保持細胞的活性。

本發明具有以下優點：