[發明專利]一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法

在審

• 申請號: 201811040100.1
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN109112102A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 馬亞東;黃宗堂;曹娜
• 申請（專利權）人: 豐澤康生物醫藥（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，屬于細胞生物學技術和再生醫學領域，取外周血多潛能間充質基質細胞進行原代培養，得到第三代細胞；將第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞與人關節軟骨細胞按共在誘導培養基中培養，本發明采用的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，外周血多潛能干細胞和軟骨細胞共培養，兩種細胞相互促進增殖和分化，可減少軟骨細胞增殖傳代次數并節省軟骨細胞數量，提高了分化率，對建立種子細胞源是提供一種高效的方法，也為擴大軟骨組織工程的細胞源提供了一種新的醫學實驗根據。

技術領域

本發明涉及一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，屬于細胞生物學技術和再生醫學領域。

背景技術

軟骨組織(Cartilage tissue)是一種富含蛋白多糖、膠原和透明質酸等物質的組織，由軟骨細胞和軟骨基質構成，在體內主要起支撐和減少摩擦的作用。但軟骨組織缺乏血管，因此，軟骨組織一旦受到損傷便很難修復，即便是微小的軟骨組織損傷，也很難自然修復。目前，臨床上用于軟骨組織損傷修復的方法主要有軟骨和軟骨下骨去除、微骨折和軟骨下骨鉆孔、自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植、軟骨或骨膜移植等。這些方法在一定程度上均能夠對軟骨組織損傷進行修復，但均存在明顯缺點，如微骨折和軟骨下骨鉆孔方法能夠使干細胞到達損傷部位，但因局部環境和機械應力不同，干細胞很難向軟骨細胞分化；自體骨軟骨移植安全、有效，但會給患者帶來新的創傷；異體骨軟骨移植避免了自體骨軟骨移植給患者帶來的新的創傷，但存在供體來源限制、免疫排斥反應和疾病傳播風險等。目前研究發現采用外周血多潛能細胞誘導培養軟骨細胞是一種非常具有潛力的技術，但是研發發現，外周血多潛能細胞的分離培養條件十分復雜因此外周血多潛能細胞誘導的形成效率低。

發明內容

針對上述技術問題，本發明提供一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法。

具體技術方案為：

一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，包括以下步驟：

(1)外周血加入枸櫞酸鈉抗凝液，然后將外周血加入到質量濃度0.9％氯化鈉注射液中，再加入質量濃度6％羥乙基淀粉，搖勻后靜置；

待分層后吸取上層細胞液，分離得到濃縮液，濃縮液用生理鹽水稀釋，然后鋪在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的分層液上面，然后離心收集分離出的干細胞層，用生理鹽水清洗干細胞得到外周血多潛能間充質基質細胞；

取外周血多潛能間充質基質細胞進行原代培養，原代培養采用的培養基，包括，人類間充質干細胞無血清培養基，還包含的胎牛血清的質量濃度為8％～15％，氨芐青霉素濃度為100～120U/mL、鏈霉素雙抗的濃度為50～100U/mL，成纖維細胞生長因子的濃度為8～13μg/L，阿米卡星的濃度為5～8mg/L；

待細胞貼壁后，用胰蛋白酶消化離心，得到原代外周血多潛能間充質基質細胞；

(2)外周血多潛能間充質基質細胞用胰蛋白酶消化處理后，得到的原代細胞置于新的培養基中進行傳代培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％CO₂；待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞；

(3)第二代細胞置于新的培養基中進行傳代培養，培養溫度為37℃，環境空氣為5％CO₂；待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離得到第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞；

(4)將所述的第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞與第二代人關節軟骨細胞按1∶1的比例接種，共在誘導培養基中培養，誘導培養時間為21天，每3天更換一次誘導培養基。