[發明專利]一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法

在審

• 申請號: 201811040100.1
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN109112102A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 馬亞東;黃宗堂;曹娜
• 申請（專利權）人: 豐澤康生物醫藥（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取外周血多潛能間充質基質細胞進行原代培養，原代培養采用的培養基，包括，人類間充質干細胞無血清培養基、胎牛血清、氨芐青霉素、鏈霉素、成纖維細胞生長因子、阿米卡星，待細胞貼壁后，用胰蛋白酶消化離心，得到原代外周血多潛能間充質基質細胞；

(2)外周血多潛能間充質基質細胞用胰蛋白酶消化處理后，得到的原代細胞置于新的培養基中進行傳代培養，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離，得到第二代細胞；

(3)第二代細胞置于新的培養基中進行傳代培養，待細胞長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化處理，然后離心分離得到第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞；

(4)將所述的第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞與人關節軟骨細胞共在誘導培養基中培養，誘導分化為軟骨細胞。

2.根據權利要求1所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，步驟(1)中所述外周血多潛能間充質基質細胞，通過以下方法獲得，外周血加入枸櫞酸鈉抗凝液，然后將外周血加入到質量濃度0.9％氯化鈉注射液中，再加入質量濃度6％羥乙基淀粉，搖勻后靜置；

待分層后吸取上層細胞液，分離得到濃縮液，濃縮液用生理鹽水稀釋，然后鋪在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的分層液上面，然后離心收集分離出的干細胞層，用生理鹽水清洗干細胞。

3.根據權利要求1所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的第三代傳代外周血多潛能間充質基質細胞與人關節軟骨細胞按1∶1的比例接種。

4.根據權利要求1所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的人關節軟骨細胞為第二代人關節軟骨細胞。

5.根據權利要求1所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的誘導培養基，以高糖DMEM為基礎培養基，還包括以下物質：魚卵母細胞提取物、牛胰島素、地塞米松、丙酮酸鈉、TGF-β3、牛血清白蛋白、脯氨酸、抗壞血酸、轉鐵蛋白、5硒酸、亞油酸。

6.根據權利要求5所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，所述的魚卵母細胞提取物，采用鯽魚卵黃充滿時相時期的魚卵，魚卵在無菌和低溫條件下取出，魚卵進行勻漿，再用等體積的DMEM稀釋、攪拌，然后凍存、解凍、離心，收集上清液，經過濾除菌后得到魚卵母細胞提取物。

7.根據權利要求1所述的一種提高外周血多潛能細胞向軟骨細胞分化的培養方法，其特征在于，步驟(4)中，誘導分化成軟骨細胞的誘導培養時間為21天，每3天更換一次誘導培養基。