[發明專利]SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法

在審

• 申請號: 201811039260.4
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109321666A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 趙艷坤;陳賀;劉慧敏;蔡建星;李進;王成
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/10;C12R1/46
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標事務所 65105
• 代理人: 楊涵;湯建武

本發明涉及乳樣中致病菌檢測技術技術領域，是一種SDS?PMA?qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其按下述步驟進行：第一步，待測乳樣SDS?PMA處理，第二步，DNA提取，第三步，qPCR擴增反應，第四步，結果測定。本發明方法在提取DNA之前，能夠更好地提取DNA，提高本檢測方法的靈敏性，在用PMA處理菌體之前，使用SDS能增強PMA對菌體的滲透性，并且合適的SDS濃度能夠有效促進PMA對死菌的滲透效果，二者結合能夠精確區分無乳鏈球菌活細胞和死細胞，總之，本發明方法不受待測乳樣中無乳鏈球菌死菌的干擾，能夠準確檢測出并定量乳中無乳鏈球菌的具體含菌量，并且特異性高，可以避免假陽性結果。

技術領域

本發明涉及乳樣中致病菌檢測技術技術領域，是一種SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法。

背景技術

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的致病菌，通常引起奶牛隱性乳房炎，它是鏈球菌屬中最具感染力和傳播速度最快的病原菌，也是人類和動物的一種重要的感染性病原菌，有可能發生食物中毒，生鮮乳中無乳鏈球菌的存在也是乳制品食物鏈中病原體的潛在來源，隨之而來的是食物污染的風險。常規生物學方法是用于檢測無乳鏈球菌的金標準，但它費力費時且特異性低，因此，建立一種快速、準確、靈敏的檢測無乳鏈球菌方法對公眾健康具有重要意義。

目前，多種快速檢測方法如聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)已被視為檢測乳或其他食品中無乳鏈球菌的可靠方法，實時熒光定量PCR(qPCR)由于其特異性和靈敏性，則可以克服常規生物學方法的這些缺點。然而，使用qPCR難以區分活細胞和死細胞，這導致了活細胞數量可能會被高估，存在假陰性和假陽性的問題。疊氮溴化丙啶(Propidium monoazide,PMA)-qPCR檢測技術是近年來興起的活菌檢測技術，主要原理是PMA能穿透死細胞和受損細胞的細胞膜，在強光下與DNA形成共價鍵，從而抑制死細胞qPCR中DNA的擴增，而活細胞未結合DNA可在qPCR反應中被擴增和檢測，以達到區分死、活菌檢測的目的。然而，當細菌暴露于低致死溫度時，PMA不能完全滲透到死細胞膜中，這表明在qPCR擴增階段，并非所有來自死細胞的DNA都能被抑制，易出現檢測值偏高，造成假陽性情況，而PMA濃度不適，也可能透過活菌的細胞膜與其DNA結合，出現假陰性結果，造成檢測結果不準確的情況。

發明內容

本發明提供了一種SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決現有技術中測定乳中無乳鏈球菌的qPCR檢測方法和PMA-qPCR檢測方法容易造成結果存在假陽性或假陰性的現象的問題。

本發明的技術方案是通過以下措施來實現的：一種SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，按下述步驟進行：第一步，待測乳樣處理：將待測乳樣搖勻，取2mL乳樣于EP管中，然后向其中加入SDS母液10⁴μg/mL 4μL、加入終濃度為10mg/mL的PMA 2μL得到混合物A，接著將混合物A于40℃恒溫培養箱中避光培養20min，避光培養完成后，繼續將混合物A放入冰水混合鐵桶內浮漂開蓋、用500W鎢絲燈照射10min，照射完成后，將混合物A于1000rpm離心10min得到沉淀A，用1mL生理鹽水洗滌沉淀A，再次離心5min得到沉淀B，用1.9mL TE buffer對沉淀B進行重懸得到懸浮液A，向懸浮液A中加入100μL終濃度為10mg/mL的溶菌酶，置于37℃恒溫培養箱培養30min至60分鐘后，于1000rpm離心10min得到沉淀C；