[發明專利]SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法

在審

• 申請號: 201811039260.4
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109321666A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 趙艷坤;陳賀;劉慧敏;蔡建星;李進;王成
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/10;C12R1/46
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標事務所 65105
• 代理人: 楊涵;湯建武

1.一種SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其特征在于按下述步驟進行：第一步，待測乳樣處理：將待測乳樣搖勻，取2mL乳樣于EP管中，然后向其中加入SDS母液10⁴μg/mL4μL、加入終濃度為10mg/mL的PMA 2μL得到混合物A，接著將混合物A于40℃恒溫培養箱中避光培養20min，避光培養完成后，繼續將混合物A放入冰水混合鐵桶內浮漂開蓋、用500W鎢絲燈照射10min，照射完成后，將混合物A于1000rpm離心10min得到沉淀A，用1mL生理鹽水洗滌沉淀A，再次離心5min得到沉淀B，用1.9mL TE buffer對沉淀B進行重懸得到懸浮液A，向懸浮液A中加入100μL終濃度為10mg/mL的溶菌酶，置于37℃恒溫培養箱培養30min至60min后，于1000rpm離心10min得到沉淀C；

第二步，DNA提?。合虺恋鞢中加入1mL 2％CTAB裂解液后用移液槍輕吹重懸得到懸浮液B，向懸浮液B加入200mg玻璃珠后密封，進行研磨兩次，然后向其中加入20μL蛋白酶K得到混合物B，將混合物B放入55℃水浴30min，每隔5min混勻一次，再70℃水浴20min，每隔5min混勻一次，接著將水浴后的混合物B于14000rpm離心5min，移取上清液、棄掉沉淀，得到上清液A，向上清液A中加入等體積的DNA提取液得到混合物C，將混合物C于14000rpm離心5min，移取上清液、棄掉沉淀，得到上清液B，向上清液B中加入等體積的DNA提取液得到混合物D，將混合物D于14000rpm離心5min，移取上清液、棄掉沉淀，得到上清液C，向上清液C中加入體積為上清液C0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻得到混合物E，將混合物E于14000rpm離心5min，棄去上清液，留取沉淀，得到沉淀D，用1mL 70％乙醇洗滌沉淀D，并于14000rpm離心10min，棄去上清，留取沉淀，得到沉淀E，將沉淀E于濾紙上干燥20min至30min，揮發乙醇，最后向沉淀E中加入100μL TE buffer重懸溶解DNA得到模板DNA；

第三步，qPCR擴增反應：首先準備引物序列，然后配制qPCR總反應體系，qPCR總反應體系的體積為25μL，qPCR總反應體系包括12.5μL Master Mix、模板DNA 2μL、引物序列中上游引物1μL、引物序列中下游引物1μL、二次蒸餾水8.5μL，配制好qPCR總反應體系后用Nanodrop 1000分光光度計測其中DNA濃度，接著將qPCR總反應體系在如下反應程序下進行30個循環反應：94℃預變性2min，94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min；

第四步，結果測定：用CFX Manager 3.1計算得到標準曲線，將Cq值換算稱logCFU值得到乳中無乳鏈球菌含量，達到定量結果。

2.根據權利要求1所述的SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其特征在于CTAB包括100nM pH為8的Tris-HCL、1.4M Nacl和20nM EDTA。

3.根據權利要求1或2所述的SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其特征在于DNA提取液為酚、氯仿、異丙醇配制而成，其中，按體積比酚：氯仿：異丙醇＝25：24：1。

4.根據權利要求1或2所述的SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其特征在于引物序列為：上游引物5'-ATGGGATTTGGGATAACTAAGCTAG-3'、下游引物5'-AGCGTGTATTCCAGATTTCCTTAT-3'。

5.根據權利要求3所述的SDS-PMA-qPCR法檢測乳中無乳鏈球菌活菌的方法，其特征在于引物序列為：上游引物5'-ATGGGATTTGGGATAACTAAGCTAG-3'、下游引物5'-AGCGTGTATTCCAGATTTCCTTAT-3'。