[發明專利]一種乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201811038647.8
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109251997A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 周勇;項周
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明建立了SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒DNA的快速方法。根據GenBank公布的乙肝病毒DNA的C基因區域的保守序列設計引物，建立了SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒和進行陰陽性判斷的方法。本發明的方法具有靈敏度高，重復性好，特異性強，成本低廉，耗時短，檢測準確等優點。

技術領域

本發明具體涉及一種乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

乙肝病毒感染是引起急、慢性肝臟疾病的主要原因。全球約有 30% 的人口，即20億人曾感染過乙肝病毒，約有3.5億慢性 HBV 感染者正面臨著發展為致死性肝病的風險，每年約有 100 萬慢性乙肝感染者死于肝硬化和肝癌。在己知的人類致癌因子中，乙肝病毒僅次于煙草位居第二。而我國作為肝炎大國，約 50%一70%的人群受過乙肝病毒感染， 8%-12%的人群為乙肝病毒表面抗原攜帶者。

目前，乙型肝炎病毒的診斷主要依賴于酶聯免疫吸附技術和PCR檢測技術。近年來實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)以其快速、簡便、特異度強、靈敏度高等一系列優點在病原體基因的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。根據熒光染料標記形式的不同，可分為非特異性擴增-雙鏈DNA嵌入熒光染料、特異擴增的熒光標記引物和特異擴增的熒光標記探針三大類，但是熒光標記引物或探針法成本較為昂貴，不利于大量臨床標本的開展。本發明采取SYBR GreenⅠ染料法，無需設計探針，成本低廉，實驗設計簡單，可同時進行熔解曲線分析評價擴增反應的特異性，為乙型肝炎病毒的早期定量診斷提供依據，對乙型肝炎臨床診斷、療效觀察和預防具有重要意義。

發明內容

本發明的技術任務在于提供一種精確、簡便的用于定量乙肝病毒血清 DNA 的方法。

本發明的一種乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，根據GenBank公布的乙肝病毒DNA的C基因區域的保守序列設計引物，建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒和進行陰陽性判斷的方法，實現了對乙肝病毒的定量檢測。

所述的一種乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：

一、根據乙肝病毒DNA的C基因區域的保守序列設計引物

依據HBV C基因序列，通過DNAMAN軟件進行序列比對，確定C基因特異序列區，在該區域設計特異性針對C基因的熒光定量引物序列如下：

上游引物HBVC-F，序列為：SEQ ID NO.1

下游引物HBVC-R，序列為：SEQ ID NO.2

二、標準曲線的構建

依據步驟一設計的引物，以 XRV 全長 Sl 基因 cDNA 為模板，進行熒光定量擴增，繪制熒光定量標準曲線

三、實驗結果判定標準

若陰性對照品無Ct值，且無規則擴增曲線，同時陽性對照品 Ct 值應小于35.0 ，擴增曲線典型，待測樣品的 Ct 值小于35.0 ，并且出現典型的擴增曲線，判斷為陽性，待測樣品無 Ct 值或者大于35并且無規則擴增曲線，判斷為陰性。

進一步地， 所述的一種乙型肝炎病毒SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述的陽性對照品為包含HBV基因組的pBS-HBV-3.6 Ⅱ質粒。

進一步地，所述的一種乙型肝炎病毒SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述的陰性對照品為PBS溶液。