[發(fā)明專利]一種DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811038144.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109136335B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭峻松;黃健;張姝;李艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6825
• 分類號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/6827
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

本發(fā)明屬于基于CH3?HS疏水結(jié)構(gòu)域液相表征特性錨定DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析，公開(kāi)了一種DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析方法。電化學(xué)方法因快速、簡(jiǎn)便、靈敏、易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，利用其研究DNA甲基化具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明甲基化DNA在液相條件下形成以甲基CH3?為內(nèi)核的“疏水球”這一物化特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化堿基位點(diǎn)的定位分析。本發(fā)明基化DNA在液相條件下形成以甲基CH3?為內(nèi)核的“疏水球”這一物化特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化堿基位點(diǎn)的定位分析。本發(fā)明提供了一系列已知甲基化位置的靶序列(DNA?S2，DNA?S3,DNA?S4,DNA?S5,DNA?S6,table?1)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基于CH3-HS疏水結(jié)構(gòu)域液相表征特性錨定DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析，尤其涉及一種DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析方法。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：DNA甲基化是表觀遺傳最基本的修飾方式，由于其對(duì)細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、遺傳性疾病和腫瘤發(fā)生等基因表達(dá)和沉默的調(diào)控作用，DNA甲基化已成為繼限制性片斷多態(tài)性、DNA點(diǎn)突變之后最具價(jià)值的第三代遺傳標(biāo)記。DNA序列特定堿基攜帶甲基CH₃-是DNA甲基化的分子本質(zhì)，檢測(cè)某一序列是否存在甲基化，并未實(shí)現(xiàn)甲基化DNA序列結(jié)構(gòu)的最終解析，DNA甲基化分析的終極目標(biāo)是甲基化堿基的位點(diǎn)定位。目前，已發(fā)展了多種DNA甲基化的檢測(cè)方法，根據(jù)檢測(cè)前對(duì)基因組DNA的處理主要分為3大類:限制性酶切、親和富集和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換。然而，這三種方法仍然存在一定的局限性?？寺y(cè)序其測(cè)試結(jié)果受到轉(zhuǎn)換是否完全和測(cè)序深度的影響，同時(shí)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，長(zhǎng)時(shí)間酸處理，易導(dǎo)致靶序列降解；另一方面，檢測(cè)后龐大的數(shù)據(jù)處理和對(duì)檢測(cè)設(shè)備的特殊要求導(dǎo)致其難以在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。MSRE分析由于限制性內(nèi)切酶對(duì)堿基序列識(shí)別的特異性，導(dǎo)致其只能對(duì)RE識(shí)別序列進(jìn)行分析，檢測(cè)范圍受到RE識(shí)別限制。更主要的是，其結(jié)果判讀是通過(guò)酶切后甲基化與非甲基化的酶切片段的電泳區(qū)帶差異進(jìn)行判斷，這即導(dǎo)致該技術(shù)只能解析某一段待測(cè)序列是否存在甲基化，而不能準(zhǔn)確判斷甲基化的確切位點(diǎn)。而甲基化芯片技術(shù)通過(guò)標(biāo)記的捕獲探針與甲基化靶序列結(jié)合后的標(biāo)記信號(hào)差異，分析待測(cè)序列是否存在甲基化。其檢測(cè)結(jié)果只能檢測(cè)一段已知序列是否存在甲基化，也不能明確甲基化的特異位點(diǎn)。因此，建立操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性好，靈敏度高的甲基化檢測(cè)方法已成為臨床診斷等領(lǐng)域愈加迫切的需求。電化學(xué)方法因快速、簡(jiǎn)便、靈敏、易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，利用其研究DNA甲基化具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本項(xiàng)目根據(jù)甲基化DNA在液相條件下形成以甲基CH3-為內(nèi)核的“疏水球”這一物化特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化堿基位點(diǎn)的定位分析。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：

(1)克隆測(cè)序其測(cè)試結(jié)果受到轉(zhuǎn)換是否完全和測(cè)序深度的影響，同時(shí)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，長(zhǎng)時(shí)間酸處理，易導(dǎo)致靶序列降解；檢測(cè)后龐大的數(shù)據(jù)處理和對(duì)檢測(cè)設(shè)備的特殊要求導(dǎo)致其難以在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

(2)MSRE分析由于限制性內(nèi)切酶對(duì)堿基序列識(shí)別的特異性，導(dǎo)致其只能對(duì)RE識(shí)別序列進(jìn)行分析，檢測(cè)范圍受到RE識(shí)別限制，導(dǎo)致該技術(shù)只能解析某一段待測(cè)序列是否存在甲基化，不能準(zhǔn)確判斷甲基化的確切位點(diǎn)。

(3)甲基化芯片技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果只能檢測(cè)一段已知序列是否存在甲基化，不能明確甲基化的特異位點(diǎn)。

解決上述技術(shù)問(wèn)題的難度和意義：