[發(fā)明專利]一種DNA甲基化特異位點(diǎn)的電化學(xué)分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811038144.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109136335B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭峻松;黃健;張姝;李艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6825
• 分類號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/6827
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

1.一種DNA甲基化特異位點(diǎn)定位的非診斷目的的電化學(xué)分析方法，其特征在于，所述電化學(xué)分析方法包括以下步驟：

步驟一：特異性位點(diǎn)甲基化DNA序列與非甲基化DNA序列的設(shè)計(jì)合成；

步驟二：電極自組裝；

步驟三：DNA電化學(xué)核酸傳感電極表征；

步驟四：DNA電化學(xué)傳感液相雜交條件優(yōu)化；

步驟五：電化學(xué)傳感液相響應(yīng)機(jī)制解析；

所述步驟一具體包括：分別設(shè)計(jì)DNA探針S1及其互補(bǔ)的不同位點(diǎn)甲基化單鏈ssDNA序列S3-S7與非甲基化單鏈ssDNA比對(duì)序列S2；S1～S7具體為：

所述步驟二具體包括：進(jìn)行電極打磨，在硝酸、丙酮和超純水中超聲洗滌，干燥備用；在已處理好的金電極表面自組裝L-半胱氨酸，將用檸檬酸三鈉還原法制備的納米金通過(guò)Au-NH鍵合于L-cys/金電極表面，制得nano-Au/L-cys/金電極；將nano-Au/L-cys/金電極放入DNA探針S1溶液中，4℃反應(yīng)12h，DNA探針S1通過(guò)Au-S與nano-Au鍵合，將電極置于巰基乙醇溶液中，封閉電極的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，制得5’-SH-DNA/nano-Au/L-cys/金電極；

所述步驟三具體包括：采用原子力顯微鏡、透射電子顯微鏡對(duì)處理好的金電極和5’-SH-DNA/nano-Au/L-cys/金電極電化學(xué)核酸傳感器表面進(jìn)行表征，觀察電極表面膜的納米粒均度和分散度；

所述步驟四具體包括：

①反應(yīng)介質(zhì)離子濃度對(duì)雜交效率及其峰電流背景干擾：PBS緩沖液中NaCl濃度0mM～200mM；

②反應(yīng)介質(zhì)pH條件對(duì)雜交效率及其峰電流背景干擾：PBS緩沖液pH5.0～8.5；

③雜交時(shí)間對(duì)雜交效率及DNA鏈內(nèi)互補(bǔ)分析：0min～180min；

④5-甲基胞嘧啶抗體濃度對(duì)甲基化檢測(cè)的影響：0ng/mL～40μg/mL，優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件；

所述步驟五具體包括：分別向反應(yīng)體系加入從1pM到5μM五倍比梯度稀釋的相應(yīng)定量甲基化和非甲基化DNA靶序列S2～S7，分別與DNA探針S1進(jìn)行雜交反應(yīng)，分別加入抗5-甲基胞嘧啶抗體及HRP標(biāo)記的二抗，記錄反應(yīng)過(guò)程中DPV電信號(hào)的變化；隨著甲基化位置逐漸遠(yuǎn)離電極表面，DPV峰電流逐漸增大導(dǎo)致CH3疏水球距離電極表面的空間位相差異。