[發明專利]一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法

有效

• 申請號: 201811036353.1
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109030835B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 吳劍卿;陳波;趙衛紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/6851
• 代理公司: 常州市夏成專利事務所(普通合伙) 32233
• 代理人: 沈毅

本發明公開了一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，包括分析Rab8通過翻譯后環節對調節膜表面Klotho表達的作用、分析Rab8調控Klotho膜表面表達在Wnt信號通路及EMT中的作用以及分析Rab8調控Klotho膜表面表達在非小細胞肺癌細胞功能學方面的作用。本發明首次發現，Rab8與Klotho結合，通過蛋白生物合成后途徑促進其向膜表面轉運，提高Klotho膜表面分布水平，抑制Wnt/β?catenin信號激活，抑制細胞發生上皮?間質轉化，從而抑制肺癌細胞遷移、侵襲。因此，Rab8具有主動調節Klotho功能。

技術領域

本發明涉及一種蛋白相互作用及相關作用機制的分析方法，具體為一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，屬于生物學應用領域。

背景技術

近年來研究者對于Rab8的相關研究興趣日增。Rab8最初從黑色素瘤細胞中被發現，被認為是轉化基因。目前認為Rab8參與了極性化細胞中新合成蛋白的轉運，從而參與了細胞形狀的調節，以及響應不同的細胞信號。Rab8通過重組肌動蛋白和微管，在膜轉運和細胞骨架動力學方面起到串聯作用，從而在細胞形態學方面具有重要影響。有報道認為Rab8參與了初級纖毛的形成及物質轉運。最近有報道Rab8參與了MT1-MMP的促侵襲活性的調控。有研究發現，Rab8在乳腺癌和轉移淋巴結中表達上調，可能與Rab8可以通過MT1-MMP促進細胞遷移有關。也有人報道Rab8在化療藥物順鉑耐藥的細胞中表達明顯升高，并發現它參與了TMEM205相關的藥物抵抗。Rab8調節膜再循環通路，與Arf6，EHD1，Myo5和Rab11相關。有假說認為Rab8在細胞表面結構域形成中具有重要作用。另有研究發現，Rab8激活誘導Rac1和Tiam1，介導皮質肌動蛋白聚合和RhoA依賴性彈性纖維分解。Rab8激活增加Rac1活性，而其缺失時將激活RhoA，導致肌動蛋白細胞骨架的重組。Rab8還和黏著斑、細胞遷移等相關。Rab8的這些功能牽涉到calpain，MT1-MMP和Rho GTP酶等。這些數據表明Rab8通過Rho GTP酶依賴和非依賴兩種方式驅動細胞活性，從而調節細胞極性的建立，黏著斑的翻轉，以及肌動蛋白細胞骨架重排，決定了細胞遷移的方向。此外，多個Rab8相互作用蛋白被證實與不同疾病相關。

目前對于Rab8功能以及Rab8相關的信號通路仍有很多未知。關于Rab8調控哪些運輸通路，Rab8通路的cargo蛋白如受體和接頭蛋白，以及Rab8相互結合蛋白方面的信息仍較匱乏。通過免疫共沉淀聯合質譜分析，我們發現并證實在非小細胞肺癌中Rab8與Klotho存在相互結合及亞細胞共定位，且Rab8可以促進Klotho蛋白膜表面表達，有必要對Rab8調控Klotho膜表面表達的機制，以及在非小細胞肺癌中的相關作用進一步研究。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的，一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，包括以下步驟：

(1)分析Rab8通過翻譯后環節對調節膜表面Klotho表達的作用，包括插入和內吞兩個相反的受體轉運過程的分析，利用切割表面生物素標記技術檢測Klotho內化，同時利用一種基于熒光的活細胞比率循環分析方法，以測量Klotho的再循環利用，結果表明Rab8并不參與Klotho內化；

(2)分析Rab8調控Klotho膜表面表達在Wnt信號通路及EMT中的作用，包括利用Western blot檢測、免疫細胞化學方法和定量RT-PCR檢測分析Rab8調控Klotho膜表面表達在Wnt信號通路中的作用，利用Western blot檢測分析Rab8調控Klotho膜表面表達在EMT中的作用；

(3)分析Rab8調控Klotho膜表面表達在非小細胞肺癌細胞功能學方面的作用，包括CCK8檢測實驗、細胞集落形成實驗、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗和移植瘤實驗。