[發明專利]一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法

有效

• 申請號: 201811036353.1
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109030835B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 吳劍卿;陳波;趙衛紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/6851
• 代理公司: 常州市夏成專利事務所(普通合伙) 32233
• 代理人: 沈毅

1.一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)分析Rab8通過翻譯后環節對調節膜表面Klotho表達的作用，包括插入和內吞兩個相反的受體轉運過程的分析，利用切割表面生物素標記技術檢測Klotho內化，同時利用一種基于熒光的活細胞比率循環分析方法，以測量Klotho的再循環利用，結果表明Rab8并不參與Klotho內化；

(2)分析Rab8調控Klotho膜表面表達在Wnt信號通路及EMT中的作用，包括利用Westernblot檢測、免疫細胞化學方法和定量RT-PCR檢測分析Rab8調控Klotho膜表面表達在Wnt信號通路中的作用，利用Western blot檢測分析Rab8調控Klotho膜表面表達在EMT中的作用；

(3)分析Rab8調控Klotho膜表面表達在非小細胞肺癌細胞功能學方面的作用，包括CCK8檢測實驗、細胞集落形成實驗、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗和移植瘤實驗。

2.根據權利要求1所述的一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于熒光的活細胞比率循環分析方法如下：

(1)表達FLAG-Klotho的A549細胞在含有結合Alexa-488的抗FLAG抗體M1的DMEM培養基中4℃下培養30分鐘，然后在37℃溫暖環境中培養30分鐘以促進內化；

(2)迅速用含1mM EDTA的冰PBS洗滌細胞3次，以分離與未發生內化的Klotho結合的Alexa-488抗FLAG抗體M1；

(3)更換含有結合Alexa-594的抗鼠IgG二抗的新鮮培養基，37℃下培養30分鐘，以標記循環回細胞表面的Klotho蛋白；

(4)每組實驗設立兩組平行對照，立即用含4％多聚甲醛的PBS固定細胞；

根據對照組紅/綠光比率計算回收蛋白質的百分比，公式如下：

回收蛋白質的百分比＝(E-Z)/(C-Z)×100，

其中E代表回收組平均比率，

Z代表0％回收對照組平均比率，

C代表100％表面對照組比率。

3.根據權利要求2所述的一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于熒光的活細胞比率循環分析方法的每個實驗中，包括兩個平行的對照組，其中一組在沒有經過EDTA處理，孵育15分鐘固定，作為100％表面對照，另一組是EDTA處理后立即固定細胞作為0％回收對照，利用熒光顯微鏡Nikon Eclipse TE 2000-U捕捉圖像，通過MetaMorph軟件循環回收蛋白進行定量。

4.根據權利要求1所述的一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述Western blot檢測中的抗體包括Wnt3兔單克隆抗體、Beta-catenin抗體和抗-Active-Beta-Catenin抗體。

5.根據權利要求1所述的一種分析Rab8調節Klotho表達在非小細胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述定量RT-PCR引物如下：

Cyclin D1-322bp

正義：5’-CCGCTGGCCATGAACTACCT-3’，

反義：5’-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT-3’；

C-myc-110bp

正義：5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3’，

反義：5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3’。