[發明專利]一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法

有效

• 申請號: 201811036352.7
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109100514B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 吳劍卿;陳波;趙衛紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/686
• 代理公司: 常州市夏成專利事務所(普通合伙) 32233
• 代理人: 沈毅

本發明公開了一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，包括Klotho相互作用蛋白的篩選、Rab8與Klotho基因相互結合的驗證、Rab8與Klotho相互作用的機制分析這三步驟。本發明首次發現，非小細胞肺癌細胞中Rab8與Klotho存在相互結合，在亞細胞中存在共定位，Rab8通過蛋白合成后途徑，與Klotho結合并以囊泡形式促進其向膜表面轉運，從而提高膜表面Klotho分布水平。

技術領域

本發明涉及一種蛋白，具體為一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，屬于生物學應用領域。

背景技術

肺癌在世界范圍內發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位。肺癌中非小細胞肺癌(NSCLC)占80％以上，5年生存率約為10％，其發病率仍在上升。因此，探索NSCLC的潛在機制，開發更加安全有效的治療方法具有十分重要的意義。肺癌系老化相關性疾病，確診肺癌的中位年齡為70歲，75-79歲年齡段是肺癌發病高峰期。隨著老化進程，基因組缺陷、表觀遺傳基因沉默、氧化應激、免疫監視缺陷、端粒異常、慢性炎癥，以及組織微環境的改變，都會使腫瘤發生風險明顯增加。因此，老化是癌癥發生的重要危險因素。此外，抑癌基因的功能缺陷或缺失也是癌癥發生的重要因素之一，對于抑癌基因在癌癥發生發展中的作用一直是研究癌癥發病機制的熱點。

本課題組近年來一直致力于抗衰老基因Klotho在肺癌中的作用及相關機制研究，結果發現Klotho除了具有抗正常細胞衰老外，在肺癌中還具有抑癌作用，肺癌組織與正常組織相比，Klotho表達明顯下降，其異常表達參與了肺癌的發生發展。

Klotho基因除具有公認的抗衰老作用外，近年研究發現其還在多種腫瘤中發揮抑癌基因作用。Klotho在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、宮頸癌、腎癌等多種腫瘤中發揮潛在抑癌基因作用。近年來，申請者及團隊對Klotho在肺癌中的作用進行了系列研究，結果證實：非小細胞肺癌中，Klotho可通過調節insulin/IGF-1、Bax/Bcl-2、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等信號通路，抑制肺癌細胞生長、遷移，促進其凋亡，改善其對化療藥敏感性。因此，通過對Klotho在腫瘤中作用的多項研究，其抑癌作用顯而易見。盡管目前圍繞Klotho的抑癌作用已有多項研究，但研究主要集中于其對下游信號的調控，對于Klotho自身的調控，Klotho相互結合蛋白間的相互作用等，認識仍非常局限。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的，一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，包括以下步驟：

a、Klotho相互作用蛋白的篩選

利用載體質粒pUltra-Klotho、包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2G共轉染293T細胞，利用流式細胞儀對病毒滴度進行分析，得到Klotho慢病毒表達載體Lenti-FLAG-Klotho，利用Lenti-FLAG-Klotho感染肺腺癌細胞系A549，以Lenti-FLAG-GFP為對照，對提取的蛋白進行免疫共沉淀實驗，篩選與Klotho高概率結合的蛋白，最終挑選出20個蛋白評分超過60分的Rab家族成員，其中Rab8蛋白評分最高；

b、Rab8與Klotho蛋白相互結合的驗證，包括外源性和內源性免疫共沉淀實驗

外源性免疫共沉淀通過FLAG-Klotho和HA-Rab8共轉染HEK293細胞，其中FLAG-Klotho和HA-Rab8是Klotho和Rab8過表達質粒，然后利用標簽抗體進行免疫共沉淀實驗分析二者的相關性，結果顯示Klotho和Rab8二者相互結合；內源性免疫共沉淀通過將A549細胞裂解，進行Rab8/Klotho免疫共沉淀實驗，結果顯示生理條件下內源性Rab8和Klotho蛋白也存在相互結合；

c、Rab8與Klotho相互作用的機制分析