[發明專利]一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法

有效

• 申請號: 201811036352.7
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109100514B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 吳劍卿;陳波;趙衛紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/686
• 代理公司: 常州市夏成專利事務所(普通合伙) 32233
• 代理人: 沈毅

1.一種分析非小細胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、Klotho相互作用蛋白的篩選

利用載體質粒pUltra-Klotho、包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2G共轉染293T細胞，利用流式細胞儀對病毒滴度進行分析，得到Klotho慢病毒表達載體Lenti-FLAG-Klotho，利用Lenti-FLAG-Klotho感染肺腺癌細胞系A549，以Lenti-FLAG-GFP為對照，對提取的蛋白進行免疫共沉淀實驗，篩選與Klotho高概率結合的蛋白，最終挑選出20個蛋白評分超過60分的Rab家族成員，其中Rab8蛋白評分最高；

b、Rab8與Klotho蛋白相互結合的驗證，包括外源性和內源性免疫共沉淀實驗

外源性免疫共沉淀通過FLAG-Klotho和HA-Rab8共轉染HEK293細胞，其中FLAG-Klotho和HA-Rab8是Klotho和Rab8過表達質粒，然后利用標簽抗體進行免疫共沉淀實驗分析二者的相關性，結果顯示Klotho和Rab8二者相互結合；內源性免疫共沉淀通過將A549細胞裂解，進行Rab8/Klotho免疫共沉淀實驗，結果顯示生理條件下內源性Rab8和Klotho蛋白也存在相互結合；

c、Rab8與Klotho相互作用的機制分析

(1)觀察Klotho和Rab8亞細胞定位情況

通過免疫熒光細胞化學方法觀察Klotho與Rab8在A549細胞中的亞細胞共定位情況，結果發現Klotho與Rab8在亞細胞中存在共定位；

(2)分析Rab8表達變化對Klotho表達的影響

構建Rab8干擾序列siRNAs，具體序列如下：

Rab8 siRNA1#siRab8-1:5'-CGA GAA GTC CTT CGA CAA CAT-3'；

Rab8 siRNA2#siRab8-2:5'-CGG AAC TGG ATT CGC AAC ATT-3'；

Rab8 siRNA3#siRab8-3:5'-TCG CCA GAG ATA TCA AAG CAA-3'；

Rab8 siRNA陰性對照siNC:5'-ATG TTG TCG AAG GAC TTC TCG-3'；

分別將上述siRab8-1、siRab8-2、siRab8-3和siNC轉染A549細胞，評估干擾效率，結果提示siRab8-3干擾效率最高，為91％，利用siRab8-3或Rab8過表達質粒Myc-Rab8轉染A549細胞，并分別通過Western blot和qRT-PCR檢測Klotho的蛋白和mRNA水平變化，結果提示，Rab8表達變化并不影響Klotho總蛋白或mRNA表達水平；

(3)觀察Rab8對Klotho膜表面表達的影響

利用生物素表面標記技術，對A549和H1299細胞系中Rab8是否參與Klotho的膜表面轉運進行了研究，將Rab8T22N、Rab8Q67L和siRab8分別轉染肺癌細胞，癌細胞以密度為1×10⁶細胞/ml種植，并參照既往實驗步驟進行，實驗結果發現，活化形式突變體Rab8Q67L可顯著提高肺癌細胞膜表面Klotho表達水平，而失活形式突變體Rab8T22N和siRab8則使Klotho膜表面表達水平明顯降低；

(4)分析Klotho的定位與其蛋白代謝的關系

將不同活化形式的Rab8，即Rab8Q67L、Rab8WT和Rab8T22N分別轉染A549細胞，并利用蛋白翻譯抑制劑放線菌酮CHX阻斷Klotho生物合成，采用western blot檢測Klotho蛋白表達水平，結果顯示，活化形式突變體Rab8Q67L組Klotho蛋白水平明顯高于Rab8野生組Rab8WT和失活形式突變體Rab8T22N組。